應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默遺傳印記基因PEG10治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：肝癌是全球性高度惡性腫瘤，預(yù)后很差，死亡率高。目前，外科手術(shù)包括肝部分切除術(shù)和肝移植仍是治療肝癌的有效手段，但是適合手術(shù)切除的患者僅有25[％]，切除后五年生存率也僅為36～50[％]，五年復(fù)發(fā)率高達(dá)85[％]。非手術(shù)治療如經(jīng)動脈導(dǎo)管化學(xué)栓塞治療(TACE)，經(jīng)皮酒精瘤內(nèi)注射(PEI)，放療，射頻消融治療(RFA)微波凝固治療(MCT)，激光熱療，中醫(yī)中藥等，方法雖然很多，但均不能達(dá)到令人滿意的療效。因此，對于肝癌尤其是中晚期肝癌

2、患者，探索更為有效的治療手段至關(guān)重要。
　　 腫瘤發(fā)病機(jī)制及靶向基因治療是近年來研究的熱點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了許多與肝癌發(fā)病相關(guān)的靶分子，但缺乏高度的特異性。因此尋找參與絕大多數(shù)肝癌發(fā)病的關(guān)鍵性特異分子靶是現(xiàn)階段肝癌基因治療迫切需要解決的問題。遺傳印記基因PEG10是來源于病毒反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的父系表達(dá)的印記基因。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果顯示，PEG10在肝癌組織中的表達(dá)具有比AFP更高的特異性。本實(shí)驗(yàn)中檢測PEG10基因mRNA和蛋白在包括肝癌

3、、胰腺癌、大腸癌、乳腺癌及宮頸癌等多種人腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá)情況，并采用RNAi技術(shù)，設(shè)計針對PEG10基因的siRNA真核表達(dá)載體，研究其對PEG10基因的抑制作用及在體內(nèi)外對肝癌生長的影響，為探討PEG10作為肝癌基因治療的新的特異性靶點(diǎn)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：RT-PCR和Western Blot分別檢測PEG10基因mRNA和蛋白在人肝癌細(xì)胞株、胰腺癌細(xì)胞株、大腸癌細(xì)胞株，乳腺癌細(xì)胞株及宮頸癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況。根據(jù)P

4、EG10基因cDNA序列，設(shè)計針對PEG10基因的4個siRNA靶序列，將其插入H1啟動子下游，克隆到真核表達(dá)載體psiRNA-hH1neo中，進(jìn)行酶切鑒定和DNA測序鑒定。將構(gòu)建好的4個重組質(zhì)粒分別命名為psiRNA1，psiRNA2，psiRNA3和psiRNA4，通過脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后，RT-PCR和實(shí)時定量PCR，檢測其對肝癌細(xì)胞PEG10基因mRNA表達(dá)的影響，Western Blot檢測轉(zhuǎn)染后PEG10蛋白表達(dá)的改變，

5、同時檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期相關(guān)因子包括Cyclin(cyclin D),CDKI(p21,p27 and p16),CDK(CDK4)和E2F1的mRNA和蛋白表達(dá)情況。MTT法、流式細(xì)胞儀和激光共聚焦檢測轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞的增殖，凋亡及細(xì)胞周期變化。在體外抗肝癌研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞建立人肝癌荷瘤裸鼠模型，在肝癌細(xì)胞接種后第14天分別將空載體和重組質(zhì)粒psiRNA2瘤內(nèi)多點(diǎn)注射進(jìn)行治療，觀察腫瘤大小變化，組織形態(tài)學(xué)及超微病理

6、改變。
　　 結(jié)果：肝癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞和大腸癌細(xì)胞中PEG10基因mRNA和蛋白均高表達(dá)，而乳腺癌細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞中未檢測到PEG10基因mRNA和蛋白的表達(dá)。成功構(gòu)建了4個特異性siRNA表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后，均不同程度地抑制了肝癌細(xì)胞PEG10基因mRNA的表達(dá)，轉(zhuǎn)染后48小時psiRNA2抑制效率最高。同時CDKI(p21和p16)mRNA表達(dá)升高，E2F1,Cyclin和CDK表達(dá)降低。WesternBlot結(jié)

7、果顯示PEG10和CDKI蛋白水平升高，而E2F1,Cyclin和CDK蛋白水平降低。肝癌細(xì)胞的生長也明顯受到抑制(P<0.05)，而乳腺癌細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞生長未受影響。流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在細(xì)胞周期各時相的分布發(fā)生明顯改變，G0/G1期細(xì)胞增多，發(fā)生G1/S期阻滯，大量HepG2細(xì)胞凋亡。激光共聚焦顯微鏡觀察到三種肝癌細(xì)胞典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)。以皮下接種培養(yǎng)肝癌細(xì)胞的方法成功建立人肝癌荷瘤裸鼠模型，經(jīng)psiRNA2、空質(zhì)粒和生理鹽

8、水多點(diǎn)瘤內(nèi)注射，psiRNA2治療組腫瘤生長受到明顯抑制，與生理鹽水組和空質(zhì)粒組比較有明顯差異(P<0.001)，抑瘤率明顯高于其他兩組，電鏡下可見明顯的細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)論：PEG10基因在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，在消化系腫瘤以外的其他腫瘤如乳腺癌和宮頸癌細(xì)胞中不表達(dá)。成功構(gòu)建針對PEG10的4個真核表達(dá)載體，其中psiRNA2的抑制效果最佳，轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后可明顯降低PEG10基因mRNA和蛋白的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)細(xì)胞