RNAi抑制內源性朊蛋白表達山羊模型的建立及相關研究.pdf

1、傳染性海綿狀腦病(Transmissible Spongiform Encephalopathies，TSE)是發(fā)生于人及其它動物上的一類致命的傳染性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要包括:羊搔癢病，牛海綿狀腦?。疮偱２。?，人克雅氏病(CJD)、GSS綜合癥、致死性家族失眠癥(FFI)等。
　　動物基因組編碼的朊蛋白(PrP)是與TSE發(fā)生直接相關的因子。研究證明內源性PrP存在是發(fā)生TSE的必要條件，缺失PrP的小鼠具有抵抗TSE的

2、能力，但一些朊蛋白基因敲除小鼠出現(xiàn)了諸如嗅覺異常、生物周期紊亂等異?，F(xiàn)象。作為自然宿主的動物如羊、牛等，PrP的缺失或下調是否具有抵抗TSE的能力？是否會產生類似朊蛋白基因敲除小鼠的異?，F(xiàn)象？因此，建立PrP表達水平不同程度下調的轉基因動物（羊或牛）模型，對上述問題的分析具有十分重要的意義。
　　RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近年來發(fā)展起來的基因轉錄后調控技術，利用RNAi抑制特定基因的表達在哺乳動物細

3、胞及轉基因小鼠中有了較為廣泛的研究。本文擬利用RNAi抑制山羊PrP的表達，獲得內源性PrP被不同程度下調的山羊胎兒成纖維細胞，并通過體細胞克隆的方法建立PrP低表達的山羊動物模型。本文主要從以下三個方面進行研究。
　　一、基于293T細胞的RNAi靶序列的篩選及對pGFP-PrP抑制效率的研究。
　　本研究的目的是在293T細胞水平上篩選獲得有效的RNAi序列。通過在線軟件設計了基于山羊朊蛋白基因(PRNP)的干擾靶序列，

4、構建了以U6為啟動子的含不同靶siRNA序列的shRNA(short hairpin RNA)干擾載體14個，并以pGFP-PrP為報告基因，將各干擾載體與pGFP-PrP共轉染293T細胞，通過觀察報告基因的熒光強弱分析各干擾載體的抑制能力的差異。同時，再利用real-time PCR分別對各轉染細胞中PrP表達量進行了定量分析。上述研究結果表明，14個shRNA干擾載體中，有7個載體(分別是pU6-A、pU6-D、pU6-E、pU6

5、-I、pU6-K、pU6-M、pU6-N)轉染后綠色熒光表達明顯減弱，并能有效的抑制轉染細胞中PrP的表達。另外，pU6-A、pU6-B還對小鼠神經(jīng)瘤細胞Neuro2a中的PrP有一定的抑制作用，而以人CMV基因及山羊PRNP基因為啟動子的shmiRNA表達載體也能有效的抑制293T細胞中pGFP-PrP的表達。
　　二、基于山羊胎兒成纖維細的各shRNA對內源性PrP的抑制研究。
　　根據(jù)上述研究結果，選擇了對293T細胞

6、中pGFP-PrP的表達具有顯著抑制作用的shRNA干擾載體pU6-D、pU6-E、pU6-I、pU6-M，分別轉染山羊胎兒成纖維細胞，通過加入嘌呤霉素抗性篩選獲得了整合有目的干擾載體的山羊胎兒成纖維單克隆細胞。再利用real-time PCR對各細胞克隆中PrP mRNA進行了定量檢測，結果顯示此四個干擾載體都能有效的抑制山羊成纖維細胞內源性的PrP的表達，其轉染后各細胞克隆的抑制效率從24.8±0.5％到94.0±1.5％不等。研究

7、結果還發(fā)現(xiàn)不僅整合有不同干擾載體的細胞克隆內源性PrP抑制水平不同，而且，來自同一干擾載體轉染后獲得的不同細胞克隆的內源性PrP mRNA被抑制的程度也不一樣（如來自pU6-D載體的7個細胞株中，抑制率分別為D1，74.6±1.2％;D2,64.6±3.8％;D5,55.0±1.1％;D8,45.6±7.2％;D9,68.8±1.0％;D10,24.8±0.5％;D11，48.9±1.1％.），其原因可能是由于整合位點的不同及拷貝數(shù)的差

8、異所引起的。
　　三、體細胞核移植制備RNAi轉基因克隆羊及對克隆羊的RNAi分析。
　　根據(jù)上述一、二的研究結果，結合轉染后的細胞生長狀態(tài)，篩選出四株細胞用于核移植羊的制備，分別是pU6-D整合的D1(抑制率為64.6±3.8％)及D2(抑制率為75.6±1.2％)，pU6-E整合的E13(抑制率為93.0±4.1％)，pU6-M整合的M2(抑制率為87.1±1.5％)，共獲得懷孕羊20個，目前已出生存活克隆羊1頭。對以D

9、1為核供體的65日齡的克隆羊胎兒的檢測結果顯示其腦中的PrP得到了有效的抑制，其抑制率（55.1±5.8％）與D1細胞相似。該結果顯示基于山羊胎兒成纖維細胞的檢測體系可較好的模擬山羊體內的RNA干擾水平，根據(jù)四個供體細胞的PrP抑制水平，我們有希望獲得內源性的PrP被相應下調的克隆羊。
　　結論:本研究首次建立了RNAi抑制內源性PrP表達的山羊模型。篩選出了高效的靶向山羊PRNP基因的siRNA片段，建立了基于山羊胎兒成纖維細胞