內源性血管抑制因子抑制眼底新生血管的機理研究.pdf

1、新生血管性疾病(Neovascularization，NV)是當今很多眼科疾病導致視力災難性喪失甚至致盲的主要原因。在正常視網膜血管的發(fā)育過程中，血管內皮細胞(Vascular endothelial cell，VEC)在各種細胞因子作用下增殖并通過細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)進行遷移有序的形成血管。而在病理性NV形成過程中，在眼的相關部位如虹膜、視網膜、及脈絡膜可形成無序的，異常形態(tài)結構及無功能的血管

2、形成。這些新生的血管很容易發(fā)生滲漏、出血、進而引起視網膜水腫、纖維增生、視網膜玻璃體出血或牽引性視網膜脫離可以導致潛在的災難性的視力喪失。
　　 本研究中，我們嘗試探討運用內源性血管抑制因子來治療和抑制眼底NV并簡要的討論眼底NV的發(fā)生機制。我們著重研究了內源性血管生長抑制因子對于眼底NV的作用機制。內源性血管抑制因子，是一組機體自身存在的抑制血管生成的負反饋分子，對機體正常生理作用的干預和影響小。在研究中我們發(fā)明了一種新的免疫

3、染色方法可以高質量定性和定量的評價視網膜新生血管(Retinal neovascularization,RNV)以及脈絡膜新生血管(Choroidal neovascularization，CNV)。本研究提供了幾種眼底NV可行的新型治療靶點，不僅可以作為有價值的研究工具，并且可能具備潛在的治療前景。
　　 1、One Click Staining一種特殊的新生血管特異性免疫組織化學染色以用于研究新生血管和巨噬細胞關系研究

4、>　　 目的:本研究的日的是研究和探索新的染色方法以提高及規(guī)范化視網膜血管和新生血管(NV)的染色，對新生血管更準確的進行定性定量分析。
　　 方法:對缺氧誘導新生血管的小鼠，在出生后17天，對其視網膜表面產生的新生血管進行免疫組織化學染色，分別運用了熒光標記的GSA lectin抗體和沒有熒光標記的抗體和不同長度的染色時間。與此同時，在缺氧誘導新生血管模型小鼠出生后的第13，15，17，19，21,23，25天進行全視網膜新

5、生血管和巨噬細胞的體外染色，鋪片拍照以觀察新生血管和巨噬細胞的關系。同時對出生后21天rho/VEGF轉基因小鼠采用同樣體外染色方法，可以特異性地染色視網膜下血管。
　　 結果:對缺氧誘導的小鼠新生血管模型（ROP模型）視網膜新生血管在用GSA標記的Lectin抗體染色40分鐘后，可以觀察到清晰的新生血管的細微結構包括新生血管前端的絲狀足突，并且視網膜原有的結構血管沒有或者僅有少量背景顏色，非常利于使用圖像分析軟件來定性和定量的

6、評價新生血管。當以GSA標記的Lectin抗體和抗F4/80的抗體或者抗iNOS的抗體進行視網膜雙重染色，結果發(fā)現(xiàn)iNOS在生長和退行過程中新生血管高表達，而在視網膜的其他部位則未見明顯表達。而且可以顯示巨噬細胞與新生血管的相關位置，進而揭示巨噬細胞和新生血管以及新生血管退化之間的關系。對缺氧誘導的小鼠新生血管模型，在不同的時點P13，P15，P17，P19，P21，P23以及P25天，運用這種染色方法觀察到視網膜表面新生血管以及巨噬細

7、胞分布，數量的明顯變化。運用這種方法染色轉基因RhoNEGF小鼠同樣可以特異的染色出其視網膜下生長的新生血管。
　　 結論:本研究描述的體外染色技術可以準確特異性地染色出新生血管。通過運用這種方法，視網膜新生血管的特異結構，得到了很好的染色顯示。聯(lián)合其他的抗體雙染視網膜新生血管，進一步揭示了新生血管和各種其他炎性因子iNOS，以及巨噬細胞的相互關系。并且提供了簡單的方法對巨噬細胞進行定義和精確計數，實驗結果顯示巨噬細胞和iNOS

8、可能與眼內血管的形成和消退緊密相關。
　　 2、內源性血管抑制因子rhEDI-8t抑制RNV和CNV
　　 目的:本研究中，我們研究了重組血管內皮抑制因子rhEDI-8t，一種從來自膠原Ⅷ的內源性蛋白質，研究其對于在病理狀態(tài)下產生的RNV、CNV的抑制作用。
　　 方法:為了研究重組內源性血管生長抑制因子rhEDI-8t對于新生血管的抑制作用，實驗分為體外實驗和體內實驗兩大部分，在體外細胞學實驗中我們通過培養(yǎng)人類

9、臍血管內皮細胞(HUVEC)，觀察血管內皮細胞增殖情況的增殖試驗，和牛主動脈內皮細胞(BAEC)遷移能力的遷移實驗。為了驗證rhEDI-8t在眼新生血管上是否有抑制作用作用。我們進一步分別運用了三種不同機制的眼新生血管動物模型，包括了激光誘導的脈絡膜新生血管(Choroidal neovascularization CNV)的小鼠動物模型，5-6周大的C57BL/6雌性小鼠按照隨機數字法隨機雙盲分為四組。對照組和只療組分別予右眼眼內注入

10、1μlPBS，或者1,2，5μg of rhEDI-8t(n=49，51，33，35;每個激光斑n=1)。第二天，使用激光光凝的方法在三個象限破壞小鼠的Bruch，s膜，并在兩周后測量CNV面積。缺氧誘導的小鼠新生血管模型( ROP)，將出生7天的B6小鼠放入75％氧箱后5天，P12天的小鼠返回正常氧濃度并給予一眼內注射1μl1μg/μl rhEDI-8t，另一眼注入磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffered saline，P

11、BS)作為對照。P17天，檢測RNV平均面積。以及視網膜光感受器細胞表達VEGF的轉基因動物模型(rho/VEGF mice)。rho/VEGF轉基因小鼠在出生后第14天，同窩小鼠的右眼隨機接受1μl(1μg/μl，n=10)endostatin或者1μl(1μg/μl，n=13) rhEDI-8t的眼內注射，而左眼則接受1μlPBS作為對照。7天后，即出生后第21天，rho/VEGF轉基因小鼠麻醉后以FITC-Dextran做心腔灌注

12、后作全視網膜鋪片并用熒光顯微鏡鏡檢以及計數。
　　 結果:內源性血管生長抑制因子rhEDI-8t在體外實驗中，有效抑制了在bFGF刺激下人類臍血管內皮細胞的增殖和牛主動脈內皮細胞的遷徙。在幾個體內新生血管動物實驗模型中，眼內注射rhEDI-8t的實驗組，不論對脈絡膜新生血管的生成，視網膜新生血管，還是視網膜下新生血管都有明顯的抑制作用，具有統(tǒng)計學差異。
　　 結論:內源性血管生長抑制因子rhEDI-8t在體內和體外實驗中