組胺酸脫羧酶基因敲除小鼠學習記憶和海馬CA1區(qū)突觸可塑性的改變.pdf

1、組胺是體內廣泛存在的自體活性物質和炎癥介質,在20世紀80年代兩個研究組同時用免疫組織化學的方法證實了組胺能神經元主要分布在下丘腦,組胺在中樞神經系統(tǒng)中的作用才逐漸為人們所承認和重視.目前認為腦內組胺能神經元廣泛分布于下丘腦的結節(jié)乳頭核(nucleus tuberomammiliaris,TM),而且TM是腦內組胺能神經元分布的唯一區(qū)域,但其軸突可以投射到腦內的絕大部分區(qū)域,包括丘腦、杏仁核、海馬結構、大腦皮層等.組胺在腦內由其前體組胺

2、酸(L-histidine)脫羧生成,組胺酸脫羧酶(histidine decarboxylase,HDC)是目前發(fā)現的唯一組胺合成酶.在中樞神經系統(tǒng),組胺有三種受體(H1、H2、H3),均已得到分離鑒定,它們屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族,具有七個跨膜區(qū)域.H1受體與磷脂酶C(phospholipase C)、蛋白激酶C(protein KinaSe C)藕聯(lián),H2受體與cAMP、蛋白激酶A(protein kinase A)耦聯(lián).H3受體

3、與Gi/Go藕聯(lián),是突觸前自身受體,對組胺的釋放有抑制作用,也影響組胺的合成.同時,它也是異源性受體,在黑質紋狀體、杏仁核、大腦皮層等區(qū)域調節(jié)其它遞質的釋放.總體上,H1和H2受體對神經元起興奮性作用,或增強其興奮性傳入.相反,H3受體激活對TM神經元產生負反饋抑制,并能抑制神經遞質的釋放. 組胺作為神經系統(tǒng)的遞質或調質,在許多中樞活動中起著重要的調節(jié)作用,如神經內分泌調節(jié)、飲水攝食調節(jié)、體溫調節(jié)、覺醒-睡眠、運動、攻擊行為以及

4、學習記憶等.學習汜憶是腦的高級功能,在許多發(fā)病率較高的中樞神經系統(tǒng)疾病中,病人的學習記憶功能均受到不同程度的損害.因此,組胺與學習記憶的關系成為越來越多的研究者致力的熱點問題.但隨著研究的深入,人們發(fā)現組胺系統(tǒng)對學習記憶的影響十分復雜,對組胺以及組胺系統(tǒng)的相關藥物在行為學方面的研究均出現不一致的結果.其中較為重要的原因是,組胺系統(tǒng)的藥理學工具特異性相對較低,并沒有選擇性的、能夠顯著持久的抑制腦內組胺合成,及同時拮抗所有組股受體的工具藥.

5、因此,越來越多的研究者采用HDC基因敲除(HDC-KO)小鼠來探討組胺長期缺乏后對學習記憶的影響.研究表明,HDC-KO小鼠對物體的辨別記憶能力較其野生型(wild type,WT)小鼠下降,而在水迷宮和被動回避反應的學習記憶能力增強,并認為其與多巴胺的負性增強有關.但是這種假設需要在其它學習汜憶模型中進一步證明,同時這些研究均停留在行為學水平,沒有探討其增強效應的深入機制.由于背景和空間學習記憶與海馬結構的突觸可塑性密切相關,在組胺的

6、長期缺乏的情況下是否影響HDC-KO小鼠的海馬的突觸可塑性,而且在學習記憶的行為學任務中,這種突觸可塑性是否發(fā)生改變,如何改變,至今仍不清楚. 因此為了進一步研究組胺長期缺乏對學習記憶的影響及其深入機制,本研究采用海馬依賴的背景恐懼記憶模型,觀察HDC-KO小鼠的學習記憶改變;同時用細胞外電生理記錄HDC-KO小鼠突觸可塑性的改變,探討行為學改變的生理機制. 第一部分HDC基因敲除小鼠背景恐懼記憶的改變 近年來,

7、恐懼條件反射模型(Pavlovian fear conditioning)逐漸成為研究學習記憶神經生物學機制的主要行為學模型,分為背景恐懼條件反射(cntextual fearconditioning)和線索恐懼條件反射(cued fear conditioning).在這個模型中,小鼠需要在訓練中將儀器背景刺激及聲音刺激(conditioned stimulus)和足底電刺激(unconditioned stimulus)聯(lián)系起來,產

8、生對背景或聲音的恐懼記憶,當小鼠再次暴露到相同背景或者在不同背景中的聲音刺激時,小鼠會表現出呆滯反應(freezing),其持續(xù)時間的長短是衡量恐懼記憶能力的標志.背景恐懼記憶而不是線索恐懼記憶依賴于海馬.為了進一步研究組胺長期缺乏在海馬依賴的學習記憶的重要作用,我們采用背景恐懼條件反射模型,觀察HDC-KO小鼠的學習記憶是否發(fā)生改變.RT-PCR和高效液相結果顯示HDC-KO小鼠不含有HDC基因,而且體內組胺含量極低.免疫印記發(fā)現HD

9、C-KO小鼠海馬細胞膜H2受體上調.行為學結果顯示,給予電刺激后,HDC-KO小鼠的呆滯反應時問百分率從2h開始較WT小鼠升高,至訓練后ld有顯著性升高,并且一直持續(xù)到訓練后14d.這些結果提示HDC-KO小鼠對背景恐懼記憶較WT小鼠顯著增強,其時程的改變提示組胺長期缺乏可能參與海馬的獲得和鞏固.我們進一步在訓練前、訓練后以及測試前腦室內注射組胺來確定背景恐懼記憶的增強,同時探討組胺的缺乏將影響獲得、鞏固和再現中的哪個過程.結果發(fā)現,在

10、訓練前、訓練后注射組胺明顯降低HDC-KO小鼠呆滯反應的時間百分率,在測試前注射沒有影響,證明組胺長期缺乏可能影響了海馬的獲得和鞏固過程,對再現過程沒有影響.對線索恐懼記憶的結果表明,HDC-KO小鼠在未受電擊的環(huán)境中受到聲音刺激時,其呆滯反應時間也延長,提示組胺長期缺乏導致的學習記憶增強對海馬的依賴可能不是特異性的. 第二部分 HDC基因敲除小鼠的突觸可塑性改變 海馬在學習記憶過程中突觸可塑性的形成重要作用,海馬的長時

11、程增強(Lorig-term potentiation,LTP) 是研究的最為廣泛的活性依賴的突觸可塑性的模型,被認為是學習記憶的神經基礎.海馬齒狀回、CA3、CA1均有習得性長時程增強的突觸效應,其中以Schaffer側支與CA1形成的通路與空問背景學習記憶關系最為密切.在第一部分中,我們已經發(fā)現組胺的長期缺乏增強HDC-KO小鼠的背景學習記憶,并影響獲得和鞏固過程.在本部分實驗中,主要研究行為學改變的突觸可塑性機制.細胞外電生理結果

12、顯示,HDC-KO小鼠的基本輸入輸出曲線(input-output CUIve)較WT小鼠沒有明顯改變,即CA1區(qū)的基本突觸傳遞并沒有因為敲除HDC基因而改變;在TBS刺激后HDC-KO小鼠的群峰電位增強的幅度明顯高于WT小鼠,即HDC-KO小鼠的LTP較、WT小鼠顯著增強,并可以持續(xù)2h直到記錄結束;10μM組胺灌流小鼠海馬腦片,給予TBS刺激誘導LTP后,其幅度明顯下降,說明HDC-KO小鼠LTP的增強是由組胺的長期缺乏特異性引起的

13、:HDC-KO小鼠的雙脈沖易化在LTP誘導前后有明顯差異,特別是誘導后較WT小鼠顯著下降,提示在LTP誘導后,HDC-KO小鼠的突觸前谷氨酸釋放增加,參與了LTP的增強效應;而在訓練后1d時,兩種基因型小鼠的LTP較正常時均明顯下降,但WT小鼠的LTP幅度反而明顯高于HDC-KO小鼠的LTP,提示HDC-KO小鼠的背景恐懼記憶明顯增強時,突觸傳遞已經維持在較高的水平,LTP出現飽和現象,進一步證明其行為學的改變,以及LTP與聯(lián)合性學習記

14、憶的相關性. 總結： 1.內源性組胺長期缺乏導致背景恐懼記憶增強,這種增強作用從訓練后2h開始,一直持續(xù)到14d.組胺腦室內注射提示,組胺長期缺乏對海馬的獲得和鞏固過程有明顯影響.HDC-KO小鼠對聲音的恐懼記憶亦增強,提示組胺長期缺乏對背景恐懼記憶的影響并不是特異性的,其不僅對海馬的功能有影響,也可能影響杏仁核的功能. 2.兩種基因型小鼠海馬腦片的電生理記錄顯示,雖然HDC-KO小鼠的輸入輸出曲線左移,但與WT

15、對照小鼠比較沒有顯著性差異,提示HDC-KO小鼠的基本電生理特性沒有發(fā)生明顯改變;內源性組胺長期缺乏導致HDC-KO小鼠海馬腦片CA1區(qū)LTP增強,而LTD沒有發(fā)生明顯變化;LTP誘導前和誘導后的PPF下降,以及生化結果發(fā)現行為學訓練后1d和4d海馬內谷氨酸含量增加,提示突觸前谷氨酸釋放增加可能參與背景恐懼記憶和LTP的增強效應; 3.HDC-KO小鼠訓練后ld海馬腦片電生理記錄顯示,LTP幅度較WT小鼠明顯降低,提示訓練后1d