COPD患者外周血巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子的表達(dá)及意義.pdf

1、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是當(dāng)今世界危害人類(lèi)健康的重要疾病，其患病率高，大約5-13％，在年齡大于40歲的人群中，患病率大約8-13％。香煙暴露和室內(nèi)空氣污染是COPD最重要的致病因素，而且隨著吸煙率的持續(xù)上升，COPD的患病率也逐漸上升，特別是婦女和發(fā)展中國(guó)家。吸煙者罹患COPD的發(fā)病率接近20％，而不吸煙者只有4％。因此，預(yù)計(jì)到2030年，COPD將逐漸上

2、升為第三位的致死病因，并給很多國(guó)家造成了很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。最近的研究顯示，慢性阻塞性肺病不僅是肺部的異常炎癥反應(yīng)，而且還是一種全身的炎癥反應(yīng)，包括系統(tǒng)性氧化應(yīng)激，循環(huán)炎癥細(xì)胞的激活和循環(huán)中炎性細(xì)胞因子水平的增加。COPD患者肺部的局部炎癥，可以通過(guò)直接釋放細(xì)胞因子和趨化因子，或間接通過(guò)激活外周血炎癥細(xì)胞來(lái)影響其他組織器官。因此，COPD不但影響中小氣道、肺實(shí)質(zhì)和肺血管，而且引起很多的合并癥，例如心血管疾病，糖尿病，抑郁，體重減輕和肌肉功能

3、異常。目前的研究證明，多種炎癥因子參與了COPD的發(fā)病發(fā)展過(guò)程，導(dǎo)致了小氣道的纖維化和肺泡的破壞。綜上所述，炎癥反應(yīng)在COPD發(fā)病機(jī)制中有著重要的地位，針對(duì)炎癥介質(zhì)的治療可能是COPD有效的抗炎治療作用點(diǎn)。但因?yàn)樘嘌装Y介質(zhì)參與了COPD的炎癥過(guò)程，針對(duì)單一的炎癥介質(zhì)并不能有很多的臨床獲益，所以明確炎癥介質(zhì)的特征和它們的相互作用，找出導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的炎癥介質(zhì)源頭，對(duì)COPD的抗炎治療是至關(guān)重要的
　　 核因子-kappaB(nuc

4、lear factor-kappaB，NF-κ B)是一種與許多基因啟動(dòng)子上κB序列特異性結(jié)合而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄功能的蛋白。在免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化和生長(zhǎng)、細(xì)胞黏附和凋亡等方面發(fā)揮著重要作用。在非激活狀態(tài)下，NF-κ B與IκB非共價(jià)結(jié)合形成復(fù)合物，在胞漿內(nèi)以無(wú)活性的二聚體形式存在。當(dāng)活化信號(hào)（包括TNF-a、LPS、氧化劑、氧自由基、放射線(xiàn)、紫外線(xiàn)、病毒及其代謝產(chǎn)物等）暴露時(shí)，NF-κB與IκB解離，促使NF-κB活化，活化的NF-

5、κB進(jìn)入核內(nèi)，結(jié)合至DNA反應(yīng)元件啟動(dòng)子，激活炎癥基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞因子、粘附分子、血管活性調(diào)節(jié)因子上調(diào)，進(jìn)一步使得下游細(xì)胞因子濃度升高，包括白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）。因此NF-κB參與炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)，而且很多研究已證明，NF-κB在COPD的發(fā)病機(jī)制起著重要作用，而作為其下游產(chǎn)物的IL-6，也被證實(shí)在COPD的炎癥反應(yīng)中起著重要作用。
　　 巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(Macrophage migra

6、tion inhibitory factor，MIF)作為一種前炎癥因子，與多種炎癥性疾病及自身免疫性疾病的發(fā)生及進(jìn)展有關(guān)，其通過(guò)NF-kB通路，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的與COPD發(fā)病過(guò)程中相同的炎癥介質(zhì)，從而在炎癥性疾病中起重要作用;而以往的研究表明NF-κB與COPD發(fā)病密切相關(guān)，由此推斷MIF可能與COPD相關(guān)，并在COPD發(fā)病過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。本研究通過(guò)測(cè)定COPD患者外周血MIF、NF-κB、IL-6的表達(dá)水平，旨在探討MIF在COP

7、D發(fā)病機(jī)制中的可能作用。
　　 目的:研究慢性阻塞性肺疾病患者外周血中巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子的表達(dá)水平及其意義。分析MIF、NF-κB、IL-6三者是否相關(guān)，初步判斷它們分別作為炎癥反應(yīng)過(guò)程中上、中、下游產(chǎn)物在COPD病程中的作用。分析MIF、NF-kappaB、IL-6三者與慢性阻塞性肺病患者FEV1％是否相關(guān)。
　　 方法:研究對(duì)象分為3組:慢性阻塞性肺病急性加重期組、穩(wěn)定期組和對(duì)照組。所有患者均接受肺功能檢查。排除標(biāo)

8、準(zhǔn):自身免疫性疾?。?lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、血管炎）、惡性腫瘤、泌尿系疾?。甭阅I小球腎炎、腎病綜合癥）、消化道疾病（肝炎、肝硬化、炎癥性腸病）、冠心病（包括心絞痛、心肌梗死）、呼吸道疾病（支氣管哮喘、過(guò)敏性鼻炎、活動(dòng)性肺結(jié)核）。入選標(biāo)準(zhǔn):COPD按2010GOLD制定的COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組無(wú)COPD，并無(wú)排除標(biāo)準(zhǔn)中相應(yīng)疾病，在性別、年齡、吸煙構(gòu)成等一般資料上與COPD組相匹配。選擇2012年2月至2012年7月慢性阻塞性

9、肺病急性加重期及穩(wěn)定期患者各25例，無(wú)慢性阻塞性肺病的對(duì)照組25例，抽取靜脈血，使用ELISA方法測(cè)定血漿MIF、IL-6的濃度，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MIF陽(yáng)性的CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的比率，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(RT-PCR)檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclearcells，PBMC) MIF-mRNA的表達(dá)水平，Western blot測(cè)定PBMC NF-κ B含量。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SP

10、SS13.0軟件，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)用x±s表示。先進(jìn)行正態(tài)分布檢測(cè)，如非正態(tài)分布，進(jìn)行排秩，排秩后采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。正態(tài)分布數(shù)據(jù)，進(jìn)行one-way ANOVA檢驗(yàn)，若方差齊，進(jìn)一步的兩兩比較采用LSD檢驗(yàn);若方差不齊，采用Welch檢驗(yàn)，進(jìn)一步的兩兩比較采用Dunnett' sT3檢驗(yàn);相關(guān)性分析:正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Pearson直線(xiàn)相關(guān)性分析，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Spearman相關(guān)性分析。

11、
　　 結(jié)果:
　　 1.急性加重期組25例，其中男20例，女5例，平均年齡(62.2±4.9)歲，平均病程7.78年，F(xiàn)EV1％ pred51.9±8.2，F(xiàn)EV1/FVC56.8±5.7;穩(wěn)定期組25例，其中男19例，女6例，平均年齡(59.2±5.1)歲，平均病程6.56年，F(xiàn)EV1％ pred53.4±7.3，F(xiàn)EV1/FVC60.9±4.4;對(duì)照組25例，其中男20例，女5例;平均年齡(59.4±4.6)歲，F(xiàn)

12、EV1％ pred87.8±5.6，F(xiàn)EV1/FVC82.5±11.3;均有吸煙史。
　　 2.淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)MIF的結(jié)果:CD4+MIF+T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率（CD4+MIF+T淋巴細(xì)胞/CD4+T淋巴細(xì)胞的百分比）在急性加重期組、穩(wěn)定期、對(duì)照組分別為(76.81±14.65)％，(60.09±16.03)％、(65.88％±16.64)％，急性加重期組相對(duì)于穩(wěn)定期組、對(duì)照組均有明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P分別為0.002，0

13、.037），穩(wěn)定期組相對(duì)于對(duì)照組并沒(méi)有獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.302）;COPD穩(wěn)定期組，CD4+MIF+T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率與FEV1％負(fù)相關(guān)（r=-0.521，P=0.008）;CD8+MIF+T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率（CD8+MIF+T淋巴細(xì)胞/CD8+T淋巴細(xì)胞的百分比）在急性加重期組、穩(wěn)定期、對(duì)照組分別為(76.94±19.96)％、(58.48±25.28)％、(55.92％±29.90)％，急性加重期組相對(duì)于穩(wěn)定期組、對(duì)照組均有明顯升

14、高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.010，0.012），穩(wěn)定期組相對(duì)于對(duì)照組并沒(méi)有獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.975);COPD穩(wěn)定期組，CD8+MIF+T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率與FEV1％負(fù)相關(guān)(r=-0.663，P＜0.01)。
　　 3.血漿MIF的檢測(cè)結(jié)果:急性加重期組、穩(wěn)定期組、對(duì)照組血漿MIF濃度分別為128.94±30.31 pg/ml,119.57±17.64 pg/ml,123.22±33.55 pg/ml，各組間均無(wú)統(tǒng)

15、計(jì)學(xué)差異(F=0.786，P=0.460)。
　　 4.血漿MIF與MIF+T淋巴細(xì)胞的相關(guān)性結(jié)果:血漿MIF與CD4+MIF+T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率無(wú)相關(guān)性，r值為0.029，P值為0.803。血漿MIF與CD8+MIF+T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率也無(wú)相關(guān)性，r值為0.142，P值為0.224。
　　 5.PBMC MIF-mRNA的表達(dá)結(jié)果:急性加重期組、穩(wěn)定期、對(duì)照組分別為0.0303±0.03075，0.0140±0.01819

16、，0.0186±0.00711，急性加重期組相對(duì)于穩(wěn)定期組、對(duì)照組均有明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.004，0.036)。穩(wěn)定期組相對(duì)于對(duì)照組并沒(méi)有獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.422)。
　　 6.MIF基因表達(dá)與蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析結(jié)果:PBMC MIF的基因表達(dá)與CD4+MIF+T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率及CD8+MIF+T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率結(jié)果一致，相關(guān)分析顯示MIF-mRNA與CD4+MIF+T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率（r=0.323，

17、P=0.010），與CD8+MIF+T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率（r=0.354，P=0.004）均成正相關(guān);與血漿MIF無(wú)相關(guān)(r=0.087，P=0.459)。
　　 7.NFκ B在COPD急性加重期組、穩(wěn)定期組、對(duì)照組的表達(dá)分別為0.9659±0.0754，0.9496±0.1439，0.9182±0.0513，3組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=1.675，P=0.194);以慢性阻塞性肺病的嚴(yán)重程度分級(jí)（Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)），NF-κ B在

18、3級(jí)患者中也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 8.IL-6在COPD急性加重期組、穩(wěn)定期組、對(duì)照組濃度(pg/ml)分別為31.88±19.46，44.46±16.18，23.86±9.93，在COPD急性加重期組、穩(wěn)定期組及對(duì)照組3組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異(x2=24.457，P＜0.01)，3組的平均秩次分別為37.94，54.54，24.52，根據(jù)平均秩次進(jìn)一步推斷，穩(wěn)定期組濃度最高，其次為急性加重期組;而在COPDⅡ級(jí)、Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)3組間

19、，IL-6也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異（x2=10.328，P=0.006），3組的平均秩次分別為20.48，35.54，29.67，根據(jù)平均秩次進(jìn)一步推斷，Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)明顯高于Ⅱ級(jí)。無(wú)論是COPD穩(wěn)定期患者還是急性加重期患者，血清IL-6的表達(dá)水平均與FEV1負(fù)相關(guān)，r分別為-0.497，-0.613，P值分別為0.011，0.001。
　　 9.CRP在COPD急性加重期組、，穩(wěn)定期組、對(duì)照組濃度(mg/L)分別為28.13±38.56

20、，8.21±16.31，2.86±4.85，在COPD急性加重期組、穩(wěn)定期組及對(duì)照組3組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異(x2=33.051， P＜0.01)，3組的平均秩次分別為55.48，38.46，20.06，根據(jù)平均秩次進(jìn)一步推斷，急性加重期組濃度最高，其次為穩(wěn)定期組。
　　 10.MIF與NF-κ B、IL-6的相關(guān)性分析結(jié)果:在COPD穩(wěn)定期組，CD4+MIF+T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率、CD8+MIF+T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率與NF-κ B相關(guān)，

21、r分別為0.497，0.854，P值分別為0.036，＜0.01;不論COPD急性加重期組還是穩(wěn)定期組，MIF（包括基因、蛋白）與IL-6之間均無(wú)相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 1.CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞MIF表達(dá)增多在COPD的急性加重過(guò)程中起作用，但不直接參與慢性阻塞性肺病的全身慢性炎癥。
　　 2.COPD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞NF-κ B無(wú)明顯升高，提示其并不直接參與慢性阻塞性肺病患者的全身慢性