LIGHT-HVEM共刺激通路在移植物抗宿主病中作用的研究.pdf

1、異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)是目前治療良、惡性血液病、重癥聯(lián)合免疫缺陷、某些自身免疫性疾病及一些實(shí)體腫瘤等疾病的重要手段。但是國(guó)內(nèi)獨(dú)生子女在新一代中,親緣供者不足10％,而非親緣供者HLA全相合的幾率則更小,因此如果進(jìn)行半相合移植,則是解決供者來(lái)源的重要手段。但是半相合移植由于組織相容性差,重度移植物抗宿主病(graft-

2、versus-host disease,GVHD)的發(fā)生率高,已知GVHD的發(fā)生主要同移植物中供者T細(xì)胞的活化相關(guān),而T細(xì)胞的活化需要由共刺激分子參與的第二信號(hào)與抗原信號(hào)(抗原肽-TCR-MHC構(gòu)成的第一信號(hào))共同存在,前期的研究已發(fā)現(xiàn)通過(guò)阻斷一些共刺激分子通路可以降低GVHD的發(fā)生。LIGHT、HVEM是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一對(duì)新的共刺激分子,該通路對(duì)T細(xì)胞的活化起正性刺激作用,但是對(duì)于該通路是否參與GVHD發(fā)病中供者T細(xì)胞活化這一重要環(huán)節(jié),

3、是否能夠通過(guò)干預(yù)這一共刺激通路來(lái)預(yù)防和治療GVHD,尚未可知。 針對(duì)以上現(xiàn)狀,本課題擬解決以下幾個(gè)主要問(wèn)題：1、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)臨床allo-HSCT患者外周血T細(xì)胞LIGHT、HVEM的表達(dá)情況以及細(xì)胞因子的分泌情況,探討LIGHT-HVEM通路和細(xì)胞因子與GVHD發(fā)生、發(fā)展間的關(guān)系；2、體外通過(guò)單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)證實(shí)應(yīng)用LIGHT單抗阻斷LIGHT-HVEM通路可誘導(dǎo)供鼠T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)已接觸過(guò)的受鼠正常組織抗原的特異性的免疫耐受

4、；3、建立MHC半相合小鼠骨髓移植急性GVHD模型,即C57BL/6小鼠(H-2b)→CB6F1小鼠(BALB/c×C57BL/6)(F1,H-2b/d),并以通過(guò)體外阻斷LIGHT-HVEM通路誘導(dǎo)對(duì)受者抗原特異性的免疫耐受的供鼠T淋巴細(xì)胞輸注給半相合骨髓移植模型的受鼠,觀察對(duì)半相合小鼠骨髓移植后急性GVHD發(fā)生的影響。 第一部分 Allo-HSCT患者T細(xì)胞LIGHT、HVEM表達(dá)及細(xì)胞因子分泌變化與GVHD發(fā)生、發(fā)展間關(guān)系

5、的研究 方法： 1、病例資料：為我科及上海市第一人民醫(yī)院2007年4月～2008年2月問(wèn)進(jìn)行異基因造血干細(xì)胞移植的患者,共26例,女性9例,男性17例,中位年齡28歲(10～51歲)。其中急性白血病15例(急性髓細(xì)胞白血病5例,急性淋巴細(xì)胞白血病10例),慢性白血病7例,惡性淋巴瘤1例,再生障礙性貧血3例,隨訪時(shí)間3個(gè)月以上。14例為同胞供者,4例為HLA半相合供者(母親供者3例,父親供者1例),無(wú)關(guān)供者8例。同時(shí)以第二

6、軍醫(yī)大學(xué)血液中心無(wú)償獻(xiàn)血者標(biāo)本15份作為正常對(duì)照。 2、預(yù)處理方案:A.環(huán)磷酰胺+足葉乙甙+全身照射:B.氟達(dá)拉濱+白消安；C.氟達(dá)拉濱+白消安+阿糖胞苷；D.環(huán)磷酰胺(再生障礙性貧血)。 3、GVHD預(yù)防：A.親緣供者：環(huán)孢霉素+短程甲氨蝶呤+霉酚酸酯:B.無(wú)關(guān)供者：環(huán)孢霉素+短程甲氨蝶呤+霉酚酸酯+抗胸腺淋巴細(xì)胞球蛋白。 4、GVHD診斷：根據(jù)患者臨床表現(xiàn)及病理學(xué)檢查,依據(jù)美國(guó)西雅圖診斷及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)GVHD進(jìn)

7、行診斷和分度。 5、流式細(xì)胞術(shù)分析：在移植前后不同時(shí)間點(diǎn)采集病人外周血分析CD3+CD4+、CD3+CD8+細(xì)胞上LIGHT、HVEM表達(dá)的變化,同時(shí)檢測(cè)正常人群LIGHT、HVEM的表達(dá)情況。 6、ELISA法檢測(cè)移植病人不同時(shí)間點(diǎn)IL-1β、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子的分泌。 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS11.5軟件包,兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),

8、兩個(gè)以上樣本均數(shù)間比較進(jìn)行One-Way ANOVA。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。 小結(jié)：急、慢性GVHD發(fā)生時(shí)T細(xì)胞LIGHT表達(dá)上調(diào),HVEM表達(dá)下調(diào),炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α表達(dá)明顯升高,急性GVHD控制后LIGHT、HVEM恢復(fù)至移植前水平,上述因素與GVHD的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。 第二部分 阻斷LIGHT-HvEM共刺激通路對(duì)T細(xì)胞增殖活化影響的研究 方法： 1、分別以C57BL/6小鼠(H-2

9、b)和經(jīng)25Gy 60Co-γ射線照射后的CB6F1小鼠(H-2b/d)脾細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞和刺激細(xì)胞,行初次單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng),在體系中加入不同濃度的抗小鼠LIGHT單抗(1μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml),同時(shí)以加入抗小鼠IgG單抗(5μg/ml)者為對(duì)照組,分別以MTT法和ELISA法檢測(cè)反應(yīng)細(xì)胞增殖情況及IFN-γ、TNF-α、IL-4等細(xì)胞因子分泌情況,按下述公式計(jì)算增殖抑制率：(對(duì)照組OD-LIGFIT單抗組OD

10、)/(對(duì)照組OD-空白孔OD)。 2、收集初次單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞,以新分離的經(jīng)照射的CB6F1小鼠脾細(xì)胞及C3H小鼠(H-2k)脾細(xì)胞作為刺激細(xì)胞行再次混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng),以MTT法檢測(cè)反應(yīng)細(xì)胞增殖情況。 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或百分率表示,均數(shù)間比較進(jìn)行One-Way ANOVA,兩樣本率的比較采用x2檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,所有統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均采用SPSS11.5軟件包進(jìn)行。

11、 小結(jié)：體外混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系中應(yīng)用LIGHT單抗可抑制反應(yīng)細(xì)胞的增殖及細(xì)胞因子分泌,誘導(dǎo)反應(yīng)細(xì)胞對(duì)刺激細(xì)胞特異性的免疫耐受。 第三部分 體外阻斷LIGHT-HVEM通路誘導(dǎo)供者T細(xì)胞特異性免疫耐受對(duì)半相合小鼠骨髓移植后急性GVHD的影響 方法： 1、以8周齡的雄性C57BL/6小鼠作為供者,8～12周齡雌性CB6F1小鼠作為受者,建立小鼠半相合骨髓移植急性GVHD模型。受鼠接受60Co-γ射線照射的預(yù)處理,總

12、劑量8Gy,劑量率150cGy/min左右,照射后4～6小時(shí)內(nèi)接受5×106供鼠骨髓細(xì)胞及6×107供鼠脾臟細(xì)胞(事先在體外與受鼠脾臟細(xì)胞在LIGHT單抗或IgG單抗存在的情況下共培養(yǎng)72小時(shí))混合后經(jīng)尾靜脈輸注給受鼠,觀察移植后56天內(nèi)急性GVHD發(fā)生情況及小鼠生存率。 2、實(shí)驗(yàn)分組如下：(1)PBS組：接受PBS0.5ml/只,n=12：(2)BM組：接受供鼠骨髓細(xì)胞5×106/只,n=12;(3)GVHD組：接受供鼠骨髓細(xì)

13、胞5×106/只及經(jīng)IgG單抗處理的供鼠脾臟細(xì)胞6×107/只,n=15;(4)LIGHT單抗干預(yù)組：接受供鼠骨髓細(xì)胞5×106/只及經(jīng)LIGHT單抗處理的供鼠脾臟細(xì)胞6×107/只,n=15。 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或百分率(％)表示,均數(shù)間比較采用方差分析(One-Way ANOVA),兩樣本率的比較采用x2檢驗(yàn),生存分析采用Kaplan-Meier法,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,所有統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均采用SPSS11.

14、5軟件處理。 小結(jié)：體外阻斷LIGHT-HVEM通路誘導(dǎo)供者特異性T細(xì)胞免疫耐受后可預(yù)防半相合小鼠骨髓移植模型中急性GVHD的發(fā)生。 結(jié)論： 1、LIGHT-HVEM共刺激通路在臨床異基因造血干細(xì)胞移植后GVHD的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用,在急、慢性GVHD發(fā)生時(shí)LIGHT表達(dá)顯著上調(diào),HVEM表達(dá)水平下調(diào),當(dāng)急性GVHD經(jīng)治療后好轉(zhuǎn)時(shí)LIGHT、HVEM表達(dá)水平恢復(fù)到正常水平。 2、阻斷LIGHT-I