HBsAg基因修飾DC瘤苗不同免疫途徑對(duì)肝癌治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝癌為我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，我國(guó)每年約有l(wèi)l萬(wàn)人死于肝癌，且發(fā)病率有上升趨勢(shì)。肝癌患者的生存時(shí)間一般低于6個(gè)月，目前臨床較為有效的治療方法有手術(shù)切除、肝移植、栓塞化療、無(wú)水酒精注射、低溫消融等，這些治療措施僅對(duì)小肝癌有較好的治療效果，對(duì)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的微小病灶其療效尚不能令人滿(mǎn)意。近年來(lái)，腫瘤的免疫治療成為腫瘤研究的新熱點(diǎn)。由于腫瘤患者機(jī)體免疫功能存在嚴(yán)重障礙，特別是樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)存在數(shù)量和功能上的缺陷，無(wú)法誘導(dǎo)初次免疫應(yīng)答和激活特異性細(xì)

2、胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)效應(yīng)，使機(jī)體無(wú)法對(duì)腫瘤抗原產(chǎn)生再次免疫應(yīng)答。為了增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，有研究者將腫瘤患者自身的DC進(jìn)行體外培養(yǎng)，并將腫瘤抗原導(dǎo)入DC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種方法可以激發(fā)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，此即為以DC為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗(簡(jiǎn)稱(chēng)DC瘤苗)。 近年來(lái)，DC瘤苗在實(shí)驗(yàn)性肝癌免疫治療中取得了良好效果，Lee等應(yīng)用肝癌細(xì)胞株Hepa1-6裂解物致敏的DC治療實(shí)驗(yàn)性小鼠肝癌，結(jié)果58.3％的小鼠腫瘤消失，對(duì)于大的肝癌也能使腫

3、瘤縮小。然而目前的DC瘤苗在肝癌治療方面存在諸多不足：(1)肝癌細(xì)胞的抗原性較弱，缺乏特異性抗原。研究發(fā)現(xiàn)只有使用典型腫瘤抗原多肽的抗原決定簇致敏DC才能誘導(dǎo)出抗腫瘤反應(yīng)，目前可以確定的腫瘤特異性抗原與腫瘤相關(guān)抗原有限，單一抗原的免疫攻擊尚不足以有效地殺滅體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，迄今人們尚未找到肝癌特異性抗原，因此，對(duì)于肝癌的免疫治療首要問(wèn)題是尋找和選擇理想的肝癌特異性抗原或相關(guān)抗原；(2)DC瘤茁在誘導(dǎo)抗腫瘤效應(yīng)的同時(shí)也誘發(fā)了嚴(yán)重的自身免疫性

4、疾病。有研究發(fā)現(xiàn)甲胎蛋白(AFP)可作為腫瘤相關(guān)抗原應(yīng)用于肝癌免疫治療，然而針對(duì)AFP的細(xì)胞免疫并不能有效治療HBV相關(guān)性肝癌。在我國(guó)，肝癌的發(fā)生與HBV感染密切相關(guān)，相關(guān)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清HBsAg檢出率高達(dá)90％以上，提示HBsAg是肝癌的重要相關(guān)抗原之一。以HBsAg作為肝癌相關(guān)抗原構(gòu)建DC瘤苗進(jìn)行免疫治療可能是一個(gè)合理的選擇。目前HBsAg—DC瘤苗對(duì)肝癌的免疫治療作用研究不多，有關(guān)HBV抗原基因修飾DC瘤苗不同途徑對(duì)肝癌

5、的免疫治療更未見(jiàn)報(bào)道。鑒此，本研究以整合HBV基因組的HepG222.1.5為細(xì)胞模型，通過(guò)攜帶有編碼HBsAg基因的重組腺病毒載體的介導(dǎo)，探討不同免疫途徑腺病毒介導(dǎo)的HBs抗原基因修飾的DC瘤苗對(duì)肝癌動(dòng)物模型的免疫治療效果，以期為HBV抗原基因修飾DC瘤苗治療肝癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料與方法： 1.小鼠DC的誘導(dǎo)培養(yǎng)和鑒定[43]：參考Inaba等技術(shù)并稍作改進(jìn)，采集小鼠骨髓細(xì)胞，通過(guò)在細(xì)胞因子GM—CSF、IL-4和T

6、NF—a刺激下，誘導(dǎo)培養(yǎng)出成熟的Dc細(xì)胞；采用流式細(xì)胞儀分析DC特異性表面分子的表達(dá)；采用MTT法進(jìn)行同種異體的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)試驗(yàn)(MLR)； 2.HBsAg基因修飾的DC(HBsAg—DC)瘤苗構(gòu)建[39]：采用重組腺病毒介導(dǎo)HBsAg基因修飾樹(shù)突狀細(xì)胞，構(gòu)建攜帶HBsAg基因的DC瘤苗； 3.肝癌動(dòng)物模型的建立[68]：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG222.1.5肝癌細(xì)胞接種于C57BL/6J小鼠腿部皮下，建立荷瘤小鼠模型

7、； 4.HBsAg—DC瘤苗對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝癌的治療：采用皮下注射、靜脈注射和瘤體注射三種途徑回輸HBsAg—DC瘤苗，比較不同治療途徑HBsAg—DC瘤苗對(duì)荷瘤C57BL/6J小鼠免疫治療作用； 5.HBsAg—DC瘤苗對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝癌的免疫保護(hù)性作用：選擇研究(4)所得的最佳免疫治療途徑，給予C57BL/6J小鼠注射HBsAg—DC瘤苗2次，后接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG222.1.5肝癌細(xì)胞(未轉(zhuǎn)染DC瘤苗和PBS做對(duì)照)，用乳

8、酸脫氫酶釋放法測(cè)定免疫小鼠脾特異性CTL殺傷活性，探討HBsAg—DC瘤苗保護(hù)性免疫反應(yīng)。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用spss12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均值士標(biāo)準(zhǔn)差((-x)±s)表示，資料采用方差統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1.DC的培養(yǎng)及鑒定 1.1在倒置顯微鏡下觀(guān)察，培養(yǎng)初可見(jiàn)有較多粘附圓形細(xì)胞，隨著時(shí)間推移，胞體出現(xiàn)樹(shù)突狀突起，繼而呈集落樣生長(zhǎng)，成熟后Dc細(xì)胞體

9、積明顯增大且形態(tài)不規(guī)則，有多個(gè)不等的突起，呈現(xiàn)特征性的星狀、樹(shù)突狀樹(shù)突樣的突起。培養(yǎng)過(guò)程所見(jiàn)符合DC形態(tài)學(xué)改變。 1.2采用免疫熒光對(duì)培養(yǎng)12d后所獲的DC細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果表明，貼壁的DC前體細(xì)胞，在體外經(jīng)過(guò)細(xì)胞因子誘導(dǎo)后，高表達(dá)CD40(81.4％)、CD80(63.5％)、CD86(72.6％)、33D1(61.7％)，具有典型的DC細(xì)胞表型標(biāo)志。 1.3為了觀(guān)察DC刺激同種異體T細(xì)胞的增殖能力

10、，我們采用MTT法進(jìn)行同種異體的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)試驗(yàn)(MLR)，結(jié)果顯示，在DC：T比例為1：1、1：5、1：10、1：20時(shí)，DC組刺激指數(shù)(SI)分別為：11.2、7.7、6.2、5.1，對(duì)照組(MNC)刺激指數(shù)(SI)分別為：3.3、2.6、1.8、1.2， (P<0.05)，DC具有很強(qiáng)的刺激同種異體T細(xì)胞的增殖能力。 2.HBsAg基因修飾DC瘤苗(HBsAg—DC)的構(gòu)建 重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠DC，通過(guò)倒置

11、熒光顯微鏡下觀(guān)察顯示，Ad—HBsAg轉(zhuǎn)染DC后48h，約90％以上DC表達(dá)示蹤的綠色熒光蛋白(EGFP)。用ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染DC中目的蛋白HBsAg的分泌，結(jié)果于感染后1～4天可檢測(cè)出高水平的HBsAg并逐日增強(qiáng)，表明重組腺病毒已經(jīng)有效介導(dǎo)HBsAg在DC中表達(dá)，成功構(gòu)建出HBsAg—DC瘤苗。 3.HBsAg—DC瘤苗回輸途徑比較及對(duì)荷瘤小鼠的治療效果 分別通過(guò)皮下、尾靜脈、瘤體內(nèi)注射HBsAg—DC瘤苗對(duì)荷瘤小鼠

12、模型治療，36天之內(nèi)腫瘤大小變化分別為：(49.00±11.42)mm2、(61.08±6.56)mm2、(65.25±18.29)mm2，經(jīng)方差統(tǒng)計(jì)分析，皮下、尾靜脈、瘤體內(nèi)注射三組之間比較有明顯差異(F=3.4675，P<0.05)，皮下注射HBsAg—DE瘤苗明顯優(yōu)于瘤體內(nèi)注射、尾靜脈注射(P<0.05)。瘤體內(nèi)注射組與尾靜脈注射組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，提示最佳免疫治療途徑為皮下注射途徑。 4.HBsAg—D

13、C瘤苗皮下免疫治療效果分析 采用皮下免疫治療，HBsAg-DE組、未轉(zhuǎn)染DC組、PBS組三組之間36天內(nèi)腫瘤大小變化分別為：(49.00±11.42)mm2、(82.83±22.48)mm2、(108.83±31.64)mm2，經(jīng)方差統(tǒng)計(jì)分析，HBsAg-DC組、未轉(zhuǎn)染DC組、PBS組三組之間比較有明顯差異(F=19.7944，P<0.01)，HBsAg-DE瘤苗組腫瘤的生長(zhǎng)明顯緩慢，未轉(zhuǎn)染DC組次之，PBS組腫瘤的生長(zhǎng)速度最快

14、(P<0.05)，提示采用皮下注射HBsAg—DC瘤苗對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝癌有一定的免疫治療作用。 5.HBsAg-DC瘤苗免疫接種后對(duì)HepG222.1.5細(xì)胞攻擊的免疫保護(hù)作用 HBsAg—DC瘤苗免疫接種后，小鼠腫瘤的生長(zhǎng)受到明顯抑制，瘤體出現(xiàn)延遲，同時(shí)生長(zhǎng)減慢。接種后18 d時(shí)仍未長(zhǎng)出腫瘤，而未轉(zhuǎn)染DC、PBS對(duì)照組小鼠均于接種后7d內(nèi)成瘤，HBsAg-DE組、未轉(zhuǎn)染DC組、PBS組三組間36天內(nèi)腫瘤大小變化分別為：(16

15、.17±6.94)mm2、(62.50±17.40)mm2、(108.83±31.64)mm2，經(jīng)方差統(tǒng)計(jì)分析，HBsAg—DC組、未轉(zhuǎn)染DC組、PBS組三組之間比較有明顯差異(F=57.1539，P<0.01)，HBsAg-DE組優(yōu)于未轉(zhuǎn)染DC組和PBS組(P<0.05)，未轉(zhuǎn)染DC組優(yōu)于PBS組(P

16、L活性檢測(cè)結(jié)果 HBsAg—DC瘤苗免疫接種后誘導(dǎo)的脾臟來(lái)源CTL對(duì)靶細(xì)胞HepGz22.1.5具有明顯的殺傷活性。統(tǒng)計(jì)分析顯示，Ad—HBs轉(zhuǎn)染DC組對(duì)HepG222.1.5細(xì)胞的殺傷率(44.67％±10.68％)，明顯高于未轉(zhuǎn)染DC組和PBS組(11.6796±4.06％和5.67％±1.76％)(F=4.4508，P<0.05)，提示HBsAg—DE瘤苗對(duì)肝癌細(xì)胞有一定的免疫保護(hù)作用是通過(guò)誘導(dǎo)脾細(xì)胞CTL來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

17、 結(jié)論： 1.通過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓來(lái)源的DC，具有很強(qiáng)的刺激同種異體T細(xì)胞的增殖能力。成功培養(yǎng)誘導(dǎo)出具有活性的DC。 2.采用重組腺病毒轉(zhuǎn)染DC，成功構(gòu)建}IBsAg基因修飾的DC瘤苗。 3.小鼠皮下注射HBsAg—DC瘤苗對(duì)肝癌的免疫治療作用明顯優(yōu)于瘤體內(nèi)注射和尾靜脈注射，提示皮下注射HBsAg—DC瘤苗可能是最佳的免疫途徑。 4.HBsAg—DC瘤苗對(duì)肝癌荷瘤小鼠產(chǎn)生有較明顯的免疫治療作用，同時(shí)能夠