新型可降解鎂鈣鍶合金體外生物學(xué)性能的研究.pdf

1、背景：
　　近年來(lái)，隨著交通行業(yè)、運(yùn)輸行業(yè)、建筑行業(yè)等行業(yè)快速發(fā)展和我國(guó)全民老齡化的到來(lái)，骨折的發(fā)病率也日益增多，因而導(dǎo)致骨折后需要植入鋼板等內(nèi)固定的患者也越來(lái)越多。目前臨床常用的鈦合金、不銹鋼、鈷鉻合金等永久性骨植入材料，但這些植入材料具有容易造成應(yīng)力遮擋、延緩骨折的愈合、治愈后需二次手術(shù)、磨屑和毒性金屬陽(yáng)離子引發(fā)炎性反應(yīng)等缺點(diǎn)。
　　基于北京大學(xué)材料學(xué)院鄭玉峰教授前期大量的體內(nèi)、體外研究數(shù)據(jù)表明，鎂鈣合金(Mg-1.0w

2、t％ Ca alloy)具有良好的生物相容性和良好的抗腐蝕性能，是較為理想的鎂合金材料，但其動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，由于其降解速率仍然較快，無(wú)法維持足夠時(shí)長(zhǎng)的機(jī)械強(qiáng)度，因而如何讓植入材料的降解速度和骨折治愈速度/骨組織重建速度匹配，是當(dāng)前需著重解決的問(wèn)題。鍶元素是人體必需的、無(wú)毒性的微量元素之一，可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和抑制破骨細(xì)胞活性，另有研究表明Sr可以明顯改善鎂的晶粒大小從而提高其耐腐蝕性能。因而我們提出將微量的鍶元素添加到鎂鈣合金材料中

3、，希望即可提高其耐腐蝕性能及機(jī)械強(qiáng)度，又具有明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的作用，因而設(shè)計(jì)出四種新型的Mg-1Ca-x wt.％ Sr合金材料，但要作為一種新型的醫(yī)用可降解金屬材料，其具體的生物學(xué)性能如何尚不清楚。
　　目的：
　　體外條件下觀察四種鎂合金材料對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、成骨礦化及溶血的影響，初步評(píng)價(jià)材料的生物相容性及生物活性，驗(yàn)證其作為一種新型醫(yī)用可降解金屬材料的安全性及有效性，為后期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用提供依據(jù);隨后進(jìn)一步探討

4、鎂鈣鍶合金介導(dǎo)成骨分化的信號(hào)通路。
　　方法：
　　1.材料的表征:通過(guò)ICP-AES分析材料的化學(xué)組成，通過(guò)光鏡及掃描電鏡觀察材料的表面形貌，并用能譜分析儀及X線衍射儀檢測(cè)材料晶界的組成及化學(xué)成分，通過(guò)pHS-2C數(shù)字式酸度計(jì)測(cè)定浸提液的pH值，通過(guò)蛋白早期粘附實(shí)驗(yàn)研究材料對(duì)蛋白的吸附能力。
　　2.生物相容性試驗(yàn):按照IS010993-12標(biāo)準(zhǔn)（試樣表面積/浸體介質(zhì)=1.25cm2/ml）分別制備各種材料浸提液并培

5、養(yǎng)細(xì)胞，空白對(duì)照組采用含10％FBS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)含量判斷有無(wú)細(xì)胞毒性，倒置顯微鏡觀察各種浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)，MTT法檢測(cè)四種材料對(duì)細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響，溶血試驗(yàn)判斷四種材料對(duì)血液紅細(xì)胞的有無(wú)溶血反應(yīng)，根據(jù)上述結(jié)果從而綜合評(píng)價(jià)四種鎂合金材料的生物安全性。
　　3.成骨礦化:采用對(duì)硝基苯磷酸酯法(p-NPP)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總蛋白及ALP活性，茜素紅染色法觀察礦化結(jié)節(jié)形成并進(jìn)行定量分析，天狼

6、星紅染色觀察膠原的分泌并進(jìn)行定量分析，進(jìn)一步采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)成骨相關(guān)基因的表達(dá)。
　　4.成骨信號(hào)通路:通過(guò)Western Blotting檢測(cè)細(xì)胞成骨分化MAPK信號(hào)通路中p-ERK1/2、p-JNK、p-P38蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.1 材料的表征
　　1.1.1 通過(guò)ICP-AES分析得出四種材料的成分和元素含量基本為Mg-1.0wt％-xwt.％Sr(x=0.2，0.5，1.0，2

7、.0)四種合金材料，與我們理想設(shè)計(jì)時(shí)的基本一致。
　　1.1.2 光鏡下金相圖可見(jiàn)四種材料隨著鍶含量的增加，隨著合金中Sr元素含量的不斷增加，合金的晶粒不斷細(xì)化，材料中晶粒更加均勻細(xì)致。
　　1.1.3 電子掃描電鏡合金中Sr元素含量的不斷增加，合金的晶粒不斷細(xì)化，合金的晶界不斷從斷續(xù)狀向連續(xù)的網(wǎng)狀變化，且合金的晶界同時(shí)會(huì)發(fā)生粗化形成片狀化現(xiàn)象。能譜分析儀可見(jiàn)鎂鈣鍶合金的晶界內(nèi)由大量的Ca和Sr組成，說(shuō)明鈣鍶主要以以第二相的

8、形式存在于晶界內(nèi)。
　　1.1.4 XRD分析儀得出四種鎂合金主要由α-Mg，Mg2Ca和Mg17Sr2。隨著Sr含量的增加，第二相中Mg17Sr2的含量也隨之增多。
　　1.1.5 PH分析儀檢測(cè)其浸提液的PH值可知，四種材料隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，其PH值均成上升趨勢(shì)，但所有的值均在8-11之間。
　　1.1.6 蛋白粘附試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)四種材料表面對(duì)蛋白的粘附無(wú)明顯差異(p＞0.05)。
　　1.2 材料的生物相容

9、性
　　1.2.1 四種材料浸提液試樣與MC3T3-E1細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)4h后，各種材料的LDH活性與空白對(duì)照組分別為(906.9±105.1) U/L，(956.7±156.2) U/L，(906.0±123.9)U/L，(925.8±40.5)U/L和(967.0±106.9) U/L，五組數(shù)據(jù)之間無(wú)明顯差異(P＞0.05)，說(shuō)明四種材料均無(wú)細(xì)胞毒性。
　　1.2.2 四種材料浸提液試樣與MC3T3-E1細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)72h后

10、，倒置熒光顯微鏡下觀察四種材料浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁良好，呈正常生長(zhǎng)，形態(tài)呈梭形，胞漿內(nèi)可見(jiàn)少量離散的黑色顆粒，未見(jiàn)明顯細(xì)胞溶解等，符合0級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。
　　1.2.3 細(xì)胞增殖活力檢測(cè)提示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組OD值逐漸升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，不同時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)差異未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，不同的時(shí)間點(diǎn)各組與空白對(duì)照組也未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);
　　1.2.4 根據(jù)四種材料浸提液與細(xì)胞共培養(yǎng)1，4

11、，7d后計(jì)算其相對(duì)增值率顯示，Mg-1Ca-0.2Sr合金，Mg-1Ca-0.5Sr合金，Mg-1Ca-1.0Sr合金，Mg-1Ca-2.0Sr合金在第一天的細(xì)胞增值率為93.2％，88.3％，104.2％，94.6％。Mg-1Ca-0.2Sr合金，Mg-1Ca-0.5Sr合金，Mg-1Ca-1.0Sr合金，Mg-1Ca-2.0Sr合金在第四天的細(xì)胞增值率為88.9％，82.1％，89.1％，101.5％。Mg-1Ca-0.2Sr合金，

12、Mg-1Ca-0.5Sr合金，Mg-1Ca-1.0Sr合金，Mg-1Ca-2.0Sr合金在第四天的細(xì)胞增值率為91.8％，98.3％，93.7％，104.5％％。四種材料的毒性評(píng)價(jià)為0級(jí)或1級(jí)，是合格的生物材料。
　　1.2.5 溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Mg-1.0wt％-x wt.％Sr(x=0.2，0.5，1.0，2.0)合金材料的溶血率依次為(％):0.21，1.48，1.05，2.01，四種材料的溶血率均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(＜5％)。<

13、br>　　1.3 成骨分化
　　1.3.1 四種材料組和空白組的胞內(nèi)蛋白總量無(wú)明顯差異，ALP活性檢測(cè)結(jié)果顯示，Mg-1.0Ca-0.5Sr、Mg-1.0Ca-1.0Sr、Mg-1.0Ca-2.0Sr三組合金OD值高于空白對(duì)照組(control group)組，且三組差異均有顯著性（P＜0.05），組間比較發(fā)現(xiàn)Mg-1.0Ca-2.0Sr合金OD值明顯高于其他三組，并有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　1.3.2 茜素紅

14、染色結(jié)果顯示:從圖中可以發(fā)現(xiàn)Mg-1.0Ca-2.0Sr浸提液培養(yǎng)的培養(yǎng)基內(nèi)可見(jiàn)大量紅染的礦化結(jié)節(jié)生成，礦化程度最高，與對(duì)照組及其他三組材料均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明Mg-1.0Ca-2.0Sr表面可促進(jìn)前成骨MC3T3-E1細(xì)胞礦化。
　　1.3.3 天狼星紅染色結(jié)果顯示:從圖中可以發(fā)現(xiàn)Mg-1.0Ca-2.0Sr浸提液培養(yǎng)的培養(yǎng)基內(nèi)可見(jiàn)細(xì)胞外基質(zhì)染色最為深染，膠原分泌最多，定量分析結(jié)果表明:Mg-1.0Ca-2.0S

15、r與對(duì)照組及其他三種材料均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明Mg-1.0Ca-2.0Sr表面可促進(jìn)前成骨MC3T3-E1細(xì)胞外基質(zhì)的膠原分泌。
　　1.3.4 RT-PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果顯示:Mg-1.0Ca-2.0Sr合金能明顯促進(jìn)ALP、OCN、RUNX2、OSX、BMP-2基因的表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Mg-1.0Ca-2.0Sr能抑制OPN基因的表達(dá)。
　　1.4 成骨分化的信號(hào)通路
　　1.4.1 通過(guò)Wes

16、tern Blotting法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn):ERK1/2通路在加入Mg-1.0Ca-2.0Sr合金材料浸提液后5min時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)磷酸化的ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表達(dá)量的增加，至30min最為明顯出現(xiàn)一個(gè)蛋白表達(dá)量峰值隨后出現(xiàn)下降，而磷酸化的JNK和P38蛋白在5min，15min，30min and60min一直保持低平，表達(dá)量未見(jiàn)明顯增多。因而初步推斷鎂鈣鍶合金促成骨分化可能通過(guò)MAPK信號(hào)通路的ERK1/2通路介導(dǎo)的.

17、r>　　結(jié)論：
　　1.四種鎂合金材料均由α-Mg，Mg2Ca和Mg17Sr2這些化合物組成，只是隨著材料中鍶含量的增加，其Mg17Sr2的含量出現(xiàn)增加，另外隨著鍶含量的增加，材料表面的晶粒大小以得到明顯細(xì)化;
　　2.四種材料表面早期蛋白黏附的結(jié)果無(wú)明顯差異;
　　3.四種鎂鈣鍶合金材料均可通過(guò)細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)，表現(xiàn)出良好的生物相容性，均為理想的植入材料;
　　4.四種材料的溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果均低于5％，具有良好的血液相