表面微弧氧化涂層鎂合金ZK60的體外生物學(xué)性能研究.pdf

1、研究背景：
　　 目前骨科臨床上常用的內(nèi)固定材料主要為傳統(tǒng)金屬，這些材料最大的弊端是需二次手術(shù)取出。此外，傳統(tǒng)金屬與骨組織的力學(xué)性能不匹配，易產(chǎn)生“應(yīng)力遮擋效應(yīng)”，導(dǎo)致骨不連或再次骨折等并發(fā)癥。生物可降解高分子材料作為上述金屬材料的替代物，雖然可避免二次手術(shù)，但同時(shí)也存在一些問(wèn)題，如體內(nèi)降解速度過(guò)快或過(guò)慢、機(jī)械強(qiáng)度不足、生物相容性不佳、易導(dǎo)致組織炎癥等。
　　 鎂合金是一種新型的生物可降解金屬材料，具有較高的比強(qiáng)度和比剛

2、度，適宜的密度及力學(xué)性能，能有效緩解應(yīng)力遮擋效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)引起人們廣泛的關(guān)注。但鎂的耐蝕性差，植入體內(nèi)降解速度過(guò)快，難以達(dá)到固定效果，并在腐蝕過(guò)程中產(chǎn)生大量的氫氣，導(dǎo)致臨床應(yīng)用受到限制。表面改性可顯著提高鎂合金的耐蝕性能，是目前醫(yī)用鎂合金應(yīng)用研究的重點(diǎn)。微弧氧化(micro-arcoxidation，MAO)是一種新興的表面改性技術(shù)，與其它技術(shù)相比，它具有成本低、工藝簡(jiǎn)單、涂層與基體結(jié)合牢固、結(jié)構(gòu)致密，良好的耐磨性及耐蝕性等優(yōu)點(diǎn)，目

3、前已在鎂合金表面改性中得到廣泛應(yīng)用。
　　 中科院金屬研究所制備了表面MAO涂層鎂合金ZK60，并已通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明了其良好的耐蝕性能。但作為一種新型的醫(yī)用可降解金屬材料，其具體的生物學(xué)性能如何尚不清楚。
　　 研究目的：
　　 體外條件下觀察表面MAO涂層鎂合金ZK60對(duì)細(xì)胞增殖、黏附、成骨礦化及溶血的影響，初步評(píng)價(jià)材料的生物相容性及生物活性，驗(yàn)證其作為一種新型醫(yī)用可降解金屬材料的安全性及有效性，為后期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

4、及臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1.材料的表性及生物相容性
　　 通過(guò)掃描電鏡觀察MAO涂層的表面形貌，并用能譜分析儀及X線衍射儀檢測(cè)涂層的元素組成及化學(xué)成分。采用間接接觸法和直接接觸法進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為裸鎂合金組、涂層組、鈦合金組及空白對(duì)照組，按照ISO10993-12標(biāo)準(zhǔn)(試樣表面積/浸體介質(zhì)=1.25cm2/ml)分別制備材料浸提液并培養(yǎng)細(xì)胞，空白對(duì)照組采用含10％FBS的H-DMEM

5、培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察浸提液中細(xì)胞形態(tài)，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞外乳酸脫氫酶(LDH)活性來(lái)評(píng)價(jià)材料的細(xì)胞毒性，并用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，掃描電鏡下觀察材料表面細(xì)胞黏附形態(tài)，檢測(cè)材料表面的蛋白吸附能力，進(jìn)一步采用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6'-diamidino-2-phenylindole，DAPI）和鈣黃綠素/乙錠均二聚物-1(calcein-AM/ethidium homodimer-1，calcein-A

6、M/EthD-1)染色法觀察細(xì)胞的早期黏附和生長(zhǎng)狀態(tài)。
　　 2.成骨礦化實(shí)驗(yàn)
　　 通過(guò)間接接觸法觀察材料對(duì)細(xì)胞成骨礦化功能的影響。實(shí)驗(yàn)分為裸鎂合金組、涂層組、鈦合金組和空白對(duì)照組。采用對(duì)硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate，p-NPP)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)活性，茜素紅染色法觀察礦化結(jié)節(jié)形成并進(jìn)行定量分析，進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PC

7、R，QRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)成骨相關(guān)基因的表達(dá)。
　　 3.溶血實(shí)驗(yàn)
　　 實(shí)驗(yàn)分為裸鎂合金組、涂層組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，參照國(guó)家醫(yī)用有機(jī)硅材料生物學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)方法GB/T16175-2008進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。肉眼觀察材料的溶血作用，計(jì)算溶血率。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.材料的表性及生物相容性
　　 1.1掃描電鏡下可見(jiàn)MAO涂層表面呈粗糙、多孔隙形態(tài)，孔隙直徑約為1μm，周?chē)鶆蚍植加形⒘?/p>

8、隙;材料橫斷面觀察可見(jiàn)鎂合金基體表面形成一約20μm的保護(hù)性涂層，涂層結(jié)構(gòu)致密，與基體結(jié)合牢固;能譜分析結(jié)果顯示涂層的主要組成元素為Mg、O和Si，同時(shí)含少量的Zn、F和K;X線衍射儀檢測(cè)提示涂層的主要成分為硅酸鎂(Mg2SiO4)和氧化鎂(MgO)。
　　 1.2顯微鏡下見(jiàn)各材料浸提液中細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，輪廓清晰，形態(tài)多呈長(zhǎng)梭形，大多細(xì)胞間以偽足形成連接，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)顆粒，未見(jiàn)明顯細(xì)胞裂解或死亡，細(xì)胞形態(tài)毒性反應(yīng)分

9、級(jí)為0級(jí)。
　　 1.3各組的LDH活性分別為裸鎂合金組(1101.5±165.2)U/L、涂層組(1195±123.5)U/L、鈦合金組(1126.5±158.5)U/L、空白對(duì)照組(1158.5±90.3)U/L，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 1.4細(xì)胞增殖活力檢測(cè)提示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組OD值逐漸升高，不同時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在浸提液培養(yǎng)細(xì)胞的第1天，裸鎂合金組及涂層組

10、的OD值低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，相對(duì)增殖率分別為90％和87％，細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)為1級(jí);而在第3天和第5天，各組間OD值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，實(shí)驗(yàn)材料組的細(xì)胞相對(duì)增殖率均為100％左右，毒性評(píng)價(jià)為0級(jí)。
　　 1.5掃描電鏡下可見(jiàn)涂層組和鈦合金組材料表面細(xì)胞密集，而裸鎂合金表面細(xì)胞數(shù)量較少;涂層組細(xì)胞為長(zhǎng)梭形或多角形，形態(tài)飽滿，細(xì)胞伸展性良好并通過(guò)偽足形成連接，與鈦合金組相比，細(xì)胞形態(tài)更佳、粘附更緊

11、密，而裸鎂合金組材料表面細(xì)胞呈梭形，形態(tài)欠飽滿，伸展性較差。
　　 1.6涂層組材料表面的蛋白吸附量為152.7±6.3（μg/ml），明顯高于裸鎂合金組和鈦合金組的96.3±3.9(μg/ml)和96.1±8.7(μg/ml)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而裸鎂合金組與鈦合金組間比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 1.7 DAPI染色示隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，各組材料表面細(xì)胞黏附數(shù)量逐漸升高，不同時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)差異

12、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，涂層組鎂合金材料表面的細(xì)胞黏附數(shù)明顯高于裸鎂合金組和鈦合金組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);在60min，裸鎂合金組和鈦合金組之間的細(xì)胞黏附數(shù)量無(wú)明顯差異(P＞0.05)，而在30min和120min，裸鎂合金組的細(xì)胞黏附數(shù)低于鈦合金組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 1.8材料表面活/死細(xì)胞染色見(jiàn)裸鎂合金組材料表面細(xì)胞數(shù)量少，大多呈圓形，細(xì)胞形態(tài)較差;而涂層組和鈦合金組

13、大多為綠染細(xì)胞，形態(tài)良好，伸出偽足粘附于材料表面，且在涂層組表面細(xì)胞顯得更飽滿，伸展性更佳。
　　 2.成骨礦化實(shí)驗(yàn)
　　 2.1各組間細(xì)胞內(nèi)總蛋白含量無(wú)明顯差異(P＞0.05)，而涂層組與裸鎂合金組中的ALP表達(dá)活性明顯高于鈦合金組和空白對(duì)照組(P＜0.01)，且涂層組的ALP活性較裸鎂合金組更高(P＜0.01)。
　　 2.2礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色見(jiàn)各組板孔內(nèi)呈不同程度的深紅色，其中涂層組染色最深，面積最廣，其次

14、為裸鎂合金組，鈦合金組與空白對(duì)照組相比外觀無(wú)明顯差異;進(jìn)一步定量分析顯示裸鎂合金組和涂層組OD值分別為0.218±0.008和0.299±0.036，明顯高于鈦合金組及空白對(duì)照組的0.109±0.001和0.112±0.006，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);其中，涂層組高于裸鎂合金組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，鈦合金組與空白對(duì)照組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。細(xì)胞的成骨礦化程度依次為:涂層組＞裸鎂合金組＞鈦合金組/空白對(duì)照

15、組。
　　 2.3成骨相關(guān)基因的表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果提示鈦合金組和空白對(duì)照組ALP、OPN、OCN和CO I四種基因的表達(dá)量均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);裸鎂合金組和涂層組的ALP基因相對(duì)表達(dá)量分別為2.155±0.339和3.990±0.181，明顯高于鈦合金組和空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且涂層組高于裸鎂合金組(P＜0.05)，結(jié)果與上文ALP活性檢測(cè)一致;裸鎂合金組和涂層組的OPN基因相對(duì)表達(dá)量分別為1.79

16、9±0.066和1.838±0.038，明顯高于鈦合金組和空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而裸鎂合金組與涂層組相比無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);OCN和COⅠ基因相對(duì)表達(dá)量裸鎂合金組和涂層組均明顯高于鈦合金組和空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且涂層組表達(dá)量較裸鎂合金組更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.溶血實(shí)驗(yàn)
　　 肉眼下可見(jiàn)涂層組離心管中上清液呈無(wú)色透明，與陰性對(duì)照組管

17、中的上清液顏色幾乎一樣，未見(jiàn)明顯溶血現(xiàn)象;裸鎂合金組的上清液呈淡紅色，有較明顯的溶血現(xiàn)象;陽(yáng)性對(duì)照組管中上清液呈玫瑰紅色，紅細(xì)胞完全破裂溶解。實(shí)驗(yàn)材料中裸鎂合金組的溶血率為28.7％，明顯高于國(guó)家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)(5％)，涂層組的溶血率僅為1.04％，且其OD值與陰性對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，符合溶血標(biāo)準(zhǔn)，不會(huì)引起明顯溶血反應(yīng)。
　　 結(jié)論：
　　 1.MAO涂層技術(shù)可在鎂合金表面形成粗糙、多孔隙的表面形態(tài);

18、r>　　 2.鎂合金ZK60及其MAO涂層材料均可通過(guò)細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)，且鎂合金表面經(jīng)MAO涂層處理后，對(duì)細(xì)胞的親和力明顯改善，促進(jìn)細(xì)胞粘附生長(zhǎng)，表現(xiàn)出良好的生物相容性;
　　 3.鎂合金ZK60及其MAO涂層材料能促進(jìn)細(xì)胞成骨分化、礦化及成骨相關(guān)基因表達(dá)，顯示出良好的骨誘導(dǎo)活性，且涂層材料的活性更高，這可能與涂層中硅酸鹽的釋放有關(guān);
　　 4.裸鎂合金ZK60具有一定的溶血作用，但表面經(jīng)MAO涂層處理后溶血率可符合生物材