P38MAPK-NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對炎癥鼻黏膜上皮細胞細胞因子及糖皮質(zhì)激素受體的調(diào)控機制.pdf

1、慢性鼻-鼻竇炎(chronic rhinosinusitis，CRS)發(fā)病機制復(fù)雜，研究提示多種細胞因子及炎性介質(zhì)有助于黏膜炎癥的持續(xù)及加重。而阻斷個別因子或介質(zhì)難以達到治療目的。我們設(shè)想：通過阻斷炎癥信號網(wǎng)絡(luò)的上游關(guān)鍵調(diào)控點，進而抑制細胞因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，以達到切斷惡性循環(huán)，減輕炎癥反應(yīng)的目的。另糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)是目前公認的最有效的抗炎藥物，已用于治療CRS。但部分患者出現(xiàn)激素抵抗。而p38絲裂原活

2、化蛋白激酶(mitogen-activited protein kinase，MAPK)及核因子-kappaB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)是炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中最重要的蛋白激酶及轉(zhuǎn)錄因子，且參與多種細胞因子、炎性介質(zhì)的調(diào)控，并可能與激素不敏感相關(guān)。另外鼻黏膜上皮細胞因參與局部組織炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)控作用而被關(guān)注，我們以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)致炎體外鼻黏膜上皮細胞為載體，試圖揭示P

3、38MAPK/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對炎癥鼻黏膜上皮細胞細胞因子、炎性介質(zhì)以及糖皮質(zhì)激素受體的調(diào)控作用，為以P38MAPK/NF-κB為靶點的治療提供理論依據(jù)。
　　 另外，本課題同時對人鼻黏膜上皮細胞原代培養(yǎng)的酶消化分離細胞方法進行探索性改進，獲得足夠數(shù)量的原代細胞以實施上述實驗。本研究分3章：
　　 第1章酶消化分離法原代培養(yǎng)人鼻黏膜上皮細胞的改進
　　 目的：探索對酶消化分離法原代培養(yǎng)人鼻黏膜上皮細胞的實驗

4、步驟和技術(shù)要點進行改進，以提高原代培養(yǎng)成功率并獲得更多數(shù)量的原代細胞，為后續(xù)實驗提供良好的培養(yǎng)模型。方法：在酶消化分離細胞、無血清培養(yǎng)法的基礎(chǔ)上，對取材處理、消化酶應(yīng)用等步驟進行了改進，如翻揭分離獲取黏膜層、消化中加入Ⅰ型DNA酶(DNase typeⅠ)、膠原酶消化后含黏膜塊的溶液中直接加入胰蛋白酶，以及應(yīng)用不包被的培養(yǎng)皿培養(yǎng)等。原代培養(yǎng)的鼻黏膜上皮細胞經(jīng)免疫熒光組織化學(xué)染色細胞角蛋白(cytokeratin,CK)8/18進行鑒定。

5、結(jié)果：鼻黏膜原代培養(yǎng)細胞生長良好，6～8d匯合可用于傳代或后續(xù)實驗。CK8/18免疫熒光染色陽性鑒定為上皮源性細胞。結(jié)論：酶消化分離細胞、無血清培養(yǎng)法可成功建立人鼻黏膜上皮細胞原代培養(yǎng)模型，對取材處理、酶消化等步驟進行上述改進，可以獲得更多數(shù)量以及純度較高的鼻黏膜上皮細胞。
　　 第2章NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對炎癥鼻黏膜上皮細胞細胞因子的調(diào)控及意義
　　 目的：探討脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘

6、導(dǎo)體外培養(yǎng)的鼻黏膜上皮細胞致炎后核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)的活性變化對局部細胞因子的調(diào)控作用，以及探索p38MAPK(mitogen-activited protein kinase，MAPK)對NF-κB激活的調(diào)節(jié)作用。方法：采用無血清原代培養(yǎng)法行正常鼻黏膜上皮細胞分離和培養(yǎng)，傳代3到4代后，經(jīng)LPS誘導(dǎo)以及加入NF-κB阻斷劑wedelolactone前后，應(yīng)用凝膠電泳遷移率分析法(el

7、ectrophoretic mobility shiftassay，EMSA)檢測NF-κB的DNA結(jié)合活性，采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測細胞因子(IL-1β，TNF-α，IL-5，IL-6，IL-8，GM-CSF，RANTES，eotaxin,eotaxin-2)，黏附分子(VCAM-1，ICAM-1)和炎性介質(zhì)(iNOS，COX-2)mRNA的表達水平。進一步采用EMSA法檢測p38MAPK特異阻斷劑SB20358

8、0對NF-κB DNA結(jié)合活性的影響。結(jié)果：LPS(1mg/L)誘導(dǎo)鼻黏膜上皮細胞使NF-κB DNA結(jié)合活性明顯增強(p=0.004)，并使IL-1β，IL-8和COX-2 mRNA的表達水平增高(p=0.000)；其它因子未誘導(dǎo)出表達；應(yīng)用NF-κB阻斷劑wedelolactone后NF-κB結(jié)合活性以及IL-1β，IL-8和COX-2 mRNA的表達水平下調(diào)，與LPS誘導(dǎo)組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(p值分別為0.002，0.000，0.0

9、00，0.000)；應(yīng)用p38MAPK阻斷劑SB203580可部分下調(diào)LPS誘導(dǎo)的NF-κB DNA結(jié)合活性的增加，有統(tǒng)計學(xué)差異(p=0.036)。結(jié)論：NF-κB通路參與了對LPS體外誘導(dǎo)鼻黏膜上皮細胞IL-1β，IL-8和COX-2轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控；p38MAPK參與了對LPS致炎鼻黏膜上皮細胞NF-κB結(jié)合活性的調(diào)節(jié)。
　　 第3章 p38MAPK/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對炎癥鼻黏膜上皮細胞糖皮質(zhì)激素受體轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控

10、>　　 目的：探討p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activited protein kinase，MAPK)和核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對炎癥鼻黏膜上皮細胞中糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用，以及p38MAPK在上述機制中對NF-κB的調(diào)控作用。方法：采用蛋白印跡法(Western blot)檢測脂多糖(lipo

11、polysaccharide，LPS)以不同濃度和于不同時間加入培養(yǎng)的鼻黏膜上皮細胞后活化的p38MAPK(磷酸化p38MAPK)表達的變化，及加入p38MAPK特異性阻斷劑SB203580對其活性的抑制作用；應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法檢測LPS致炎鼻黏膜上皮細胞后GR亞型GRα和GRβ轉(zhuǎn)錄水平的變化，以及加入SB203580

12、和NF-κB阻斷劑Wedelolactone后對受體mRNA表達的抑制作用；應(yīng)用凝膠電泳遷移率分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)法檢測SB203580對NF-κB DNA結(jié)合活性的抑制作用。結(jié)果：隨著LPS濃度的增加(0.01mg/L，0.1mg/L)，鼻黏膜上皮細胞中磷酸化p38MAPK的表達升高，但無統(tǒng)計學(xué)差異(p=0.424，0.99)；當(dāng)LPS的刺激濃度為1mg/L時表達最

13、高(p=0.001)；濃度為10Mg/L時不再繼續(xù)升高(p=.002)。LPS刺激鼻黏膜上皮細胞15min時磷酸化p38MAPK的表達即升高(p=0.006)；30min時表達最高(p=0.009)；45min后漸降(p=.021)，60min時表達量已經(jīng)很低，與未加LPS組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p=1.000)。在加入LPS之前30min加入p38特異性阻斷劑SB203580可抑制p38MAPK活性(p=.001)。未加LPS時，GR

14、αmRNA即有較高表達，而GRβ mRNA表達微量；LPS誘導(dǎo)鼻黏膜上皮細胞GRβ mRNA表達顯著升高(p=0.011)，且能被SB203580抑制以及被Wedelolactone不完全抑制，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.01)。而GRα在LPS刺激后雖有增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.05)，且未能被阻斷劑抑制。LPS刺激鼻黏膜上皮細胞后NF-κB的DNA結(jié)合活性升高，可被SB203580部分抑制(p=0.036)。結(jié)論：