HSP90基因多態(tài)性與嚴(yán)重創(chuàng)傷后多器官功能障礙的關(guān)系及其阻斷劑的抗炎作用機(jī)制.pdf

1、隨著社會(huì)的進(jìn)步和現(xiàn)代化交通工具的發(fā)展，嚴(yán)重創(chuàng)傷及并發(fā)的多器官功能障礙無(wú)疑成為常見(jiàn)而重要的臨床危重疾病，尤其是多器官功能衰竭，是臨床危重患者的重要死因之一。然而創(chuàng)傷程度相同（ISS評(píng)分相當(dāng)）的患者發(fā)生這種并發(fā)癥的幾率并不相同，經(jīng)過(guò)相同的治療后有的患者病情減輕，有的患者病情不斷惡化。隨著人類基因組研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到遺傳背景的差異是包括創(chuàng)傷在內(nèi)的多種疾病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　熱休克蛋白(Heat shock pr

2、otein，HSP)是廣泛存在于從細(xì)菌到真核生物細(xì)胞內(nèi)的保守的分子伴侶蛋白，在機(jī)體遭受創(chuàng)傷、感染、手術(shù)、缺氧、重金屬、放射等應(yīng)激條件下大量增加，保護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。HSP90作為熱休克蛋白的一種，有眾多與炎癥相關(guān)的客戶蛋白，其中包括具有抑炎效應(yīng)的HPA軸的重要效應(yīng)分子GR和具有促炎作用的TLR4信號(hào)通路的相關(guān)分子等。鑒于HSP90在炎癥反應(yīng)中的重要作用，其基因多態(tài)性與創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)及器官功能的損傷有何關(guān)系，如何提高HSP90的抑炎效應(yīng)

3、是本課題的關(guān)注重點(diǎn)。
　　為此，本課題擬對(duì)重慶地區(qū)部分漢族人和嚴(yán)重創(chuàng)傷患者的HSP90β基因SNP進(jìn)行檢測(cè)、分析和比較，了解各SNP的發(fā)生頻率及其基因型分布特點(diǎn)，并采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)不同基因型攜帶者的白細(xì)胞LPS刺激后HSP90β基因表達(dá)水平的變化及炎性因子的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)構(gòu)建含不同HSP90基因型啟動(dòng)子的熒光素酶表達(dá)載體驗(yàn)證SNP對(duì)HSP90β基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。在此基礎(chǔ)上，觀察不同的基因型與嚴(yán)重創(chuàng)傷患者的多器官功能的損

4、傷嚴(yán)重程度的關(guān)系，進(jìn)一步明確HSP90β基因SNPs在創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)以及多器官功能中的臨床意義。
　　此外，盡管HSP90的保護(hù)作用已經(jīng)得到認(rèn)可，但是在不同的損傷模型中的作用機(jī)制尚不明確。有研究表明HSP90阻斷劑也具有減輕炎癥反應(yīng)、降低膿毒癥小鼠死亡率的保護(hù)效應(yīng)，這與公認(rèn)的觀點(diǎn)相悖，如何調(diào)控HSP90才能使其更好發(fā)揮抑炎的保護(hù)作用，本課題擬對(duì)HSP90及其阻斷劑看似矛盾的作用進(jìn)行研究，以期闡明HSP90及其阻斷劑產(chǎn)生保護(hù)作用的機(jī)

5、制和條件。本課題通過(guò)CLP所致膿毒癥模型和LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞模型檢測(cè)不同劑量條件下HSP90阻斷劑17-AAG的作用，并分析主要抑炎信號(hào)通路GC-GR通路和促炎的TLR4信號(hào)通路，以及二者之間的關(guān)系，為發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)有效的抗炎藥物提供理論支持和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　主要結(jié)果與結(jié)論如下：
　　1.重慶人群中HSP90β基因啟動(dòng)子區(qū)存在七個(gè)高頻突變位點(diǎn)，分別為-741G/C、-509C/T、-427A/C、-398 C/G、-257G/A、

6、-144C/A和-141 T/C，其突變頻率分別為0.260、0.250、0.250、0.220、0.313、0.285和0.434。其中-741G/C、-509C/T、-427A/C、-398 C/G、-257G/A五個(gè)位點(diǎn)呈緊密連鎖，-144C/A、-141 T/C位點(diǎn)之間以及與以上五個(gè)位點(diǎn)之呈連鎖不平衡關(guān)系。
　　2.體外轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明突變型-144A啟動(dòng)子較野生型-144C啟動(dòng)子具有更高的轉(zhuǎn)錄活性，可以促進(jìn)靶基

7、因的轉(zhuǎn)錄。定量PCR的結(jié)果證實(shí)-144突變型基因攜帶者的外周血白細(xì)胞具有較高的HSP90β的基礎(chǔ)表達(dá)，并且在LPS誘導(dǎo)的炎癥模型中具有較低的炎性因子TNF-α的表達(dá)，表明此位點(diǎn)為功能性多態(tài)位點(diǎn)，通過(guò)改變啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)而調(diào)節(jié)HSP90β基因的表達(dá)。
　　3.進(jìn)一步的臨床關(guān)聯(lián)研究表明HSP90β基因-144AA基因型患者的多器官功能評(píng)分顯著低于-144CC基因型，表明此位點(diǎn)SNP與嚴(yán)重創(chuàng)傷后各器官功能損傷的嚴(yán)重程度有關(guān)，我們推測(cè)-

8、144位點(diǎn)突變導(dǎo)致的HSP90β表達(dá)水平的差異是導(dǎo)致炎癥反應(yīng)差異性的重要原因之一，在嚴(yán)重創(chuàng)傷患者并發(fā)癥的發(fā)生和進(jìn)展中具有重要意義。
　　4.在CLP小鼠膿毒癥模型和LPS刺激的細(xì)胞模型中較低濃度的17-AAG(0.1μM)可以促發(fā)以HSP90表達(dá)增高為特征的熱休克反應(yīng)，降低TFN-α、IL-1β等炎癥因子的表達(dá)水平，但較高濃度的17-AAG(0.5μM)盡管使HSP90蛋白水平增高，卻具有相反的作用，增加炎癥因子的表達(dá)，加重?fù)p傷。

9、
　　5.在小鼠膿毒癥模型中17-AAG可以顯著的提高3h和24h時(shí)相點(diǎn)P-HSF1的水平因而提高HSP90的蛋白表達(dá)。低劑量17-AAG(0.5mg/kg)可以顯著降低24h時(shí)相點(diǎn)TLR4的表達(dá)，而高劑量17-AAG(2.5mg/kg)對(duì)TLR4的表達(dá)無(wú)顯著影響。
　　6.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)表明低和高劑量的17-AAG都可以顯著的提高P-HSF1的水平，進(jìn)而促進(jìn)HSP90的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，并且呈劑量依賴性增高。但是僅當(dāng)?shù)蜐舛鹊?7

10、-AAG(0.1μM)存在時(shí)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用，并且主要是通過(guò)促進(jìn)GC-GR信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)其調(diào)節(jié)的下游靶基因Lipocortin-1的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。與此相反，高濃度的17-AAG(0.5μM)盡管增加了HSP90的表達(dá)水平，卻可以抑制HSP90的活性進(jìn)而阻斷GC-GR信號(hào)通路，抑制Lipocortin-1的生成，進(jìn)而促進(jìn)炎性因子TFN-α的產(chǎn)生，加重?fù)p傷。
　　7.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明分別單獨(dú)給予低濃度的17-AAG(0.1μM)和DE

11、X(50nM)都可降低TLR4的蛋白水平，并且二者同時(shí)使用具有協(xié)同作用，使TLR4的表達(dá)在24h表達(dá)更低。已有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明HSP90的增加可以促進(jìn)GR的核轉(zhuǎn)位而增強(qiáng)GR效應(yīng)，因此我們推測(cè)表明17-AAG通過(guò)增加HSP90的表達(dá)促進(jìn)DEX介導(dǎo)的GR效應(yīng)，間接發(fā)揮抗炎保護(hù)效應(yīng)。
　　總之，HSP90是一種具有保護(hù)作用的分子已被廣泛認(rèn)可，較低劑量的HSP90阻斷劑由于其具有促進(jìn)熱休克反應(yīng)和對(duì)客戶蛋白的調(diào)節(jié)的差異性，使得較低濃度的阻斷劑1