小檗堿對乳腺癌細(xì)胞的放射增敏作用及其機制研究.pdf

1、背景與目的:
　　 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，全球每年約有上百萬人罹患乳腺癌。放射治療作為乳腺癌局部和區(qū)域治療的重要手段，涵蓋著乳腺癌綜合治療的各個方面。但乳腺癌患者在接受放射治療的過程中亦可能出現(xiàn)放療后復(fù)發(fā)、放射抗拒、副作用大等一系列情況。因此目前放療生物學(xué)研究主要集中在如何提高腫瘤放療的治療增益比(therapeutic gain factor，TGF)，即增加放射對正常組織損傷和腫瘤殺傷之間的差別，提高射線對腫瘤殺

2、滅的生物效應(yīng)。增強腫瘤的放射敏感性，減輕放射的副作用是現(xiàn)在醫(yī)學(xué)函待解決的問題。小檗堿又稱黃連素，是從毛茛科植物黃連的干燥根莖提取的一種異喹啉類生物堿。小檗堿具有抗心律失常、心力衰竭以及降低血壓、血脂和血糖和治療消化性潰瘍及免疫調(diào)節(jié)等多種作用。近年來多項研究表明小檗堿還對多種腫瘤細(xì)胞具有明顯抑制效果。小檗堿主要通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等機制實現(xiàn)抗腫瘤作用。它還能減輕放療所致的肺損傷和腸粘膜損傷，通過誘導(dǎo)自噬對非小細(xì)

3、胞肺癌起到放射增敏作用，通過下調(diào)RAD51提高食管癌的放療敏感性。本課題主要研究小檗堿是否在乳腺癌放射治療中具有增敏作用，并對其機制進行初步探討。
　　 研究方法:
　　 通過平板克隆實驗檢測小檗堿對人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7和MDA-MB-468)是否具有放射增敏效果。DMSO或15μM小檗堿預(yù)處理細(xì)胞后予X線照射（0，1，2，3和4 Gy）。鋪入培養(yǎng)皿標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)2～3周，觀察克隆形成情況。計算克隆形成率及細(xì)胞存活分

4、數(shù)。用線性二次模型進行細(xì)胞存活曲線擬合。用線性回歸分析對細(xì)胞存活曲線進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，比較小檗堿對乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞周期變化的影響。將細(xì)胞分為放療組和小檗堿聯(lián)合放療組，其中聯(lián)合組加入15μM小檗堿預(yù)處理24h，兩組細(xì)胞分別接受X線(6Gy)照射后0h、8h和12h時收集細(xì)胞。以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析。
　　 通過免疫熒光實驗檢測小檗堿處理對乳腺癌細(xì)胞

5、接受X線照射后γ-H2AX焦點的形成與持續(xù)情況的影響。將細(xì)胞接種于帶有飛片的六孔板，15μM小檗堿預(yù)處24h后進行X線照射(1.0Gy)，于0h、0.5h、4h和12h處理細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察。
　　 通過western Blotting實驗檢測小檗堿對乳腺癌細(xì)胞接受X線照射前后細(xì)胞內(nèi)RAD51、Ku70和Ku86的表達量有無影響。15μM小檗堿處理乳腺癌細(xì)胞24-48h后，檢測RAD51、Ku70和Ku86的表達情況。15μ

6、M小檗堿處理乳腺癌細(xì)胞24h，予X線照射后0h，2h，6h和24 h檢測Ku70、Ku86和RAD51的表達，與單純放療組比較。
　　 結(jié)果:
　　 本研究中通過平板克隆形成實驗觀察到小檗堿對乳腺癌MCF-7和MDA-MB-468細(xì)胞具有明顯的放射增敏作用。X線單獨處理MCF-7細(xì)胞時，其SF2為31.2±0.8％，而與小檗堿聯(lián)合處理后其SF2降為20.5±3.9％，P=0.002。在MDA-MB-468細(xì)胞中可以看到類

7、似的結(jié)果，單純放療組SF2為33.1±3.1％，小檗堿聯(lián)合放療組SF2為20.1±0.6％，P＜0.01。用線性二次模型進一步分析數(shù)據(jù)擬合細(xì)胞存活曲線，線性回歸分析顯示兩條曲線間有明顯的統(tǒng)計差異(P＜0.001)。在另一種乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-468中可以看到類似的結(jié)果，小檗堿與放療聯(lián)合組SF2為20.1±0.6％，而單純放療組為33.1±3.1％，(P＜0.01)。線性回歸分析顯示兩條曲線間有明顯的統(tǒng)計差異(P＜0.001)。

8、r>　　 腫瘤細(xì)胞在經(jīng)過離子輻射后細(xì)胞周期進程會延緩，出現(xiàn)G1/S期和（或）G2/M期的停滯，對損傷的DNA進行修復(fù)，避免出現(xiàn)致死性損傷，從而增強細(xì)胞的放射抵抗性。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，小檗堿可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞（MCF-7和MDA-MB-468）細(xì)胞周期改變，G0/G1期細(xì)胞增多(P＜0.05)，S期細(xì)胞明顯減少(P＜0.05)，G2/M期變化不明顯。小檗堿聯(lián)合放療組與單純放療組相比放療誘導(dǎo)的G2/M期阻滯明顯減少(P＜0.05)。

9、
　　 γ-H2AX是DNA損傷的敏感指標(biāo)。通過免疫熒光法檢測顯示，單純放療組在0.5h時呈現(xiàn)大量的γ-H2AX焦點，在4h時焦點數(shù)明顯減少，12h時焦點基本恢復(fù)到本底水平。而小檗堿與放療聯(lián)合組γ-H2AX焦點清除明顯滯后，0.5h時呈現(xiàn)大量的γ-H2AX焦點，在4h時焦點數(shù)無明顯減少，12h時焦點仍未恢復(fù)至本底水平。提示小檗堿與X線聯(lián)合處理可以阻礙X線引起的乳腺癌MCF-7細(xì)胞的DNA DSBs修復(fù)。
　　 DNA雙鏈

10、斷裂可以通過同源重組(homologous recombination，HR)和非同源重組(non-homologous end joining，NHEJ)兩個基本過程被修復(fù)。參與HR修復(fù)的主要蛋白包括Rad51、BRCA1、BRCA2等，參與NHEJ修復(fù)的主要蛋白包括DNA-PKcs，Ku等。利用western Blotting方法檢測發(fā)現(xiàn)，小檗堿可以使乳腺癌細(xì)胞RAD51表達下調(diào)，小檗堿聯(lián)合放療組中RAD51持續(xù)顯著下調(diào)，Ku70、