大鼠內嗅皮層微注射Orexin-A對睡眠—覺醒及空間記憶的影響.pdf

1、1998年發(fā)現(xiàn)的Orexin是一類小分子神經肽，也稱hypocretin(hypocretin-1和hypocretin-2)，由外側下丘腦Orexin神經元產生，有兩個單體：Orexin-A和Orexin-B。它們是來自同一基因轉錄產物。Orexin-A由33個氨基酸構成，其中有四個半胱氨酸形成鏈內的二硫鍵。Orexin系統(tǒng)主要通過Orexin-1(OXIR)受體和Orexin-2(OX2R)受體發(fā)揮作用，兩受體均為G-蛋白偶聯(lián)受體，

2、OX1R和Orexin-A的親和力高于Orexin-B，而OX2R與Orexin-A和Orexin-B親和力相同。Orexin神經元的投射幾乎遍布大腦的各個腦區(qū)，在維持覺醒中具有重要的意義，并且基因敲除小鼠或其受體基因突變可引起發(fā)作性睡眠病[1]。同時，研究發(fā)現(xiàn)Orexin神經元可以投射到海馬(Hp)，與空間學習記憶密切相關[2-4]。
　　 內嗅皮層(entorhinalcortex，EC)在海馬和聯(lián)合皮層的雙向信息交流中起著

3、接替站的作用。EC淺層主要神經元接受新皮層的輸入，投射至海馬。深層主要接受海馬CA1和下托的輸入，將其傳回至新皮層。EC參與形成的海馬-EC-新皮層環(huán)路在情景記憶的形成以及鞏固中發(fā)揮重要的作用[5]。EC可分為外側內嗅皮層(LEC)和內側內嗅皮層(MEC)。目前認為MEC主要參與傳遞和處理空間信息，在空間認知功能中具有重要的意義[6-9]。
　　 本研究采用多導睡眠記錄和微注射技術，首先觀察內嗅皮層內，外源性的OrexinA對大

4、鼠睡眠.覺醒周期時間的影響，然后采用T-迷宮交替選擇模式初步觀察內嗅皮層OrexinA對大鼠空間記憶的影響，之后采用曠場實驗觀察微注射OrexinA對大鼠運動功能及探索行為的影響。結果如下：
　　 1.Orexin受體在EC中的表達及在淺層中與reelin和calbindin的共表達
　　 對成年大鼠EC腦片進行OX1R和OX2R免疫熒光化學檢測，觀察Orexin受體在EC中正常表達和在淺層中與reelin和calbin

5、din的共表達情況。結果顯示：淺層中OX1R的表達較深層要高得多，OX2R在EC中的表達模式與OX1R類似；OX1R在reelin陽性細胞和calbindin陽性細胞中均有表達，表明OX1R可能廣泛表達于EC淺層的主要神經元中。同時考慮到EC的reelin和calbindin信號在空間學習記憶中的重要作用，這也暗示了Orexin受體在空間學習記憶中的重要作用。
　　 2.OrexinA對睡眠-覺醒周期的影響
　　 在內嗅

6、皮層腦區(qū)微注射不同劑量OrexinA，觀察大鼠睡眠.覺醒的變化。與ACSF自身對照相比，分別給大鼠內側內嗅皮層雙側微注射不同濃度的0.04nmol，0.06nmol，0.1nmol OrexinA后3小時11:00～12:00、12:00～13:00、13:00～14:00覺醒周期時間無影響(P>0.05)，給藥后24 h覺醒周期時間也無顯著差異(P>0.05)。及在11:00～14:003小時內對覺醒時間無影響(P>0.05)，在11

7、:00～14:003 h內NREM時間無影響(P>0.05)，在11:00～14:003小時后REM也無影響(P>0.05)，即對3h內(11:00～14:00)大鼠總睡.眠覺醒時間無顯著性差異(P>0.05)。結果顯示大鼠內嗅皮層微注射OrexinA對它的睡眠，覺醒周期無影響。
　　 3.OrexinA受體阻斷劑SB-334867對睡眠-覺醒周期的影響
　　 在內嗅皮層腦區(qū)微注射Orexin A受體阻斷劑SB-3348

8、67，觀察睡眠-覺醒周期變化。與DMSO自身對照相比，給大鼠內側內嗅皮層雙側微注射SB-334867(0.1nmol，5μl)后3小時11:00～12:00、12:00～13:00、13:00～14:00覺醒周期時間無影響(P>0.05)，給藥后24 h覺醒周期時間也無顯著差異(P>0.05)。及在11:00～14:003小時內對覺醒時間無影響(P>0.05)，在11:00～14:003 h內NREM時間無影響(P>0.05)，在11:

9、00～14:003小時后REM也無影響(P>0.05)，即對3 h內(11:00～14:00)大鼠總睡-眠覺醒時間無顯著性差異(P>0.05)。表明大鼠內嗅皮層微注射SB-334867對睡眠.覺醒周期無影響。
　　 4.EC腦區(qū)OrexinA對空間記憶的影響
　　 1)OrexinA受體阻斷劑SB-334867對空間記憶的影響
　　 在內嗅皮層腦區(qū)微注射，分別按兩種T-迷宮模式(保持模式，獲得模式)，觀察對空間記

10、憶的影響。連續(xù)訓練大鼠，在內側內嗅皮層區(qū)微注射，對大鼠DMSO組間對照和OrexinA受體阻斷劑SB-334867給藥后的T-迷宮選擇正確次數(shù)進行統(tǒng)計。給大鼠內嗅皮層雙側微注射SB-334867(6mM，0.5μl)，T-迷宮交替選擇正確次數(shù)明顯減少，正確率下降78%，有顯著性差異(p<0.05)。提示SB-334867影響了空間記憶，降低了空間記憶功能。即內嗅皮層內源性OrexinA促進了空間記憶功能。
　　 2)敲低Orex

11、in A受體表達(RAAV2/1-OR1-shRNA-EGFP)對大鼠空間記憶的影響
　　 大鼠內嗅皮層微注射手術，在內嗅皮層腦區(qū)微注射空白對照組SCR(RAAV2/1-SCR-shRNA-EGFP)及干擾組OR1(RAAV2/1-OR1-shRNA-EGFP)，觀察內嗅皮層敲低Orexin A受體表達后對大鼠空間記憶的影響。以SCR對照在內嗅皮層微注射OR1干擾病毒，分兩組，對大鼠SCR組間對照組和OR1干擾組分別21天后開始

12、T-迷宮訓練，訓練持續(xù)21天。對其結果進行統(tǒng)計，交替選擇正確次數(shù)減少，正確率下降48%，有顯著性差異(p<0.05)。提示，敲低Orexin A受體表達，降低了空間記憶功能。即內嗅皮層OrexinA受體參與了且提高了空間記憶能力。
　　 5.術后內嗅皮層微注射藥物對大鼠探索行為及運動功能的影響
　　 大鼠內嗅皮層套管埋置手術恢復后，在內嗅皮層腦區(qū)微注射對照ACSF，DMSO以及藥物組Orexin A及其受體阻斷劑SB-3

13、34867，觀察對探索行為和運動功能的影響。在內嗅皮層分別微注射藥物(ACSF，DMSO，orexin A，SB-334867)分四組，對大鼠ACSF，DMSO組間對照和OrexinA及受體阻斷劑SB-334867給藥15min后在曠場中的站立次數(shù)和所走的格子數(shù)進行統(tǒng)計。給大鼠內嗅皮層微注射(0.1nmol，0.5μl)Orexin A，大鼠的站立次數(shù)和行走的格子數(shù)無明顯變化，無顯著性差異(P>0.05)；微注射(6mM，0.5μl)O

14、rexin A受體阻斷劑SB-334867，大鼠站立次數(shù)和行走的格子數(shù)無明顯變化，無顯著差異(P>0.05)。表明術后內嗅皮層微注射藥物對大鼠探索行為及運動功能無影響。
　　 綜上所述，本研究結果表明：一，EC區(qū)OR1在reelin陽性和calbindin陽性神經元中都有表達。二，EC微注射不同劑量OrexinA對大鼠的睡眠-覺醒周期無影響。三，EC微注射Orexin A受體阻斷劑SB-334867對大鼠睡眠.覺醒周期無影響。四