內(nèi)嗅皮層-海馬輸出端的空間探索功能圖譜.pdf

1、目的:內(nèi)嗅皮層與海馬在空間學(xué)習(xí)記憶、空間探索與導(dǎo)航等方面起著至關(guān)重要的作用。海馬內(nèi)的位置細胞，內(nèi)側(cè)內(nèi)嗅皮層的網(wǎng)格細胞、頭朝向細胞、邊界細胞、速率細胞等參與本體方位感覺的形成，從而在空間探索和導(dǎo)航中發(fā)揮作用。內(nèi)嗅皮層與海馬之間的纖維聯(lián)系:內(nèi)嗅皮層Ⅱ?qū)由窠?jīng)元軸突纖維投射至DG區(qū)分子層，Ⅲ層神經(jīng)元投射至CA1區(qū)分子層，DG區(qū)顆粒細胞軸突纖維經(jīng)過CA3區(qū)投射與CA1區(qū)形成突觸聯(lián)系，在CA1區(qū)綜合所有信息輸入后傳出至內(nèi)嗅皮層深層（Ⅴ，Ⅵ層）。介于

2、內(nèi)嗅皮層與海馬在空間探索與導(dǎo)航功能中的協(xié)同與差異，以及在纖維聯(lián)系上的鮮明特點，我們希望利用光纖探測系統(tǒng)的鈣信號光學(xué)記錄方法探究MECⅡ-DG連接通路軸突末梢對空間探索的功能編碼。
　　方法:(1)利用腦立體定位注射的方法，將AAV病毒（AAV-Syn-GCaMP5G）注射至MECⅡ?qū)?，待其感染神?jīng)元后在胞內(nèi)大量繁殖并表達鈣熒光指示蛋白(GCaMP5G)，從而標記MECⅡ-DG連接通路。(2)利用光纖探測系統(tǒng)，將光纖埋植到DG區(qū)分子

3、層記錄MECⅡ?qū)由窠?jīng)元軸突末梢的鈣信號，結(jié)合探索行為，以及系列對照實驗:對eGFP標記小鼠MECⅡ-DG軸突末梢的記錄;MEC淺層注射Muscimol或TTX對軸突末梢鈣信號的影響;以及MECⅡ-DG軸突末梢鈣信號進行長期記錄。(3)通過對小鼠在圓盆中自由探索時MECⅡ-DG軸突末梢鈣信號與探索行為的聯(lián)合分析;對非探索行為如在滾輪上單純跑動，梳理毛發(fā)和吃食物等的鈣信號變化的分析;對視覺輸入在空間探索中作用的研究來論證MECⅡ-DG軸突末

4、梢鈣信號參與空間探索的功能編碼。(4)利用四通道光纖系統(tǒng)在MECⅡ-DG軸突末梢同時記錄4個位點的空間探索鈣信號，和在不同小鼠上記錄軸突末梢不同區(qū)域的空間探索鈣信號，從而描繪MECⅡ-DG軸突末梢的空間探索功能編碼特點。
　　結(jié)果:(1) AAV病毒主要感染MECⅡ?qū)由窠?jīng)元，大量繁殖并表達鈣熒光指示蛋白(GCaMP5G);少量Ⅲ層神經(jīng)元被標記且胞內(nèi)GCaMP5G的表達量均比較低;海馬DG區(qū)分子層來自MECⅡ?qū)由窠?jīng)元的軸突末梢被密集

5、標記，GCaMP5G表達豐度很高;CA1區(qū)分子層被GCaMP5G標記的軸突末梢數(shù)量較少。(2) MECⅡ-DG軸突末梢鈣信號在麻醉狀態(tài)下以一定節(jié)律同步發(fā)放，自由探索時則呈現(xiàn)非同步連續(xù)發(fā)放;在eGFP標記小鼠軸突末梢未記錄到類似鈣信號的基線變化;MEC淺層注射Muscimol或TTX后軸突末梢鈣信號被明顯阻斷，TTX的阻斷效果不可逆，Muscimol被代謝清除后軸突末梢鈣信號得以恢復(fù);GCaMP5G標記小鼠軸突末梢鈣信號可以長期穩(wěn)定記錄長

6、達14天以上。(3) MECⅡ-DG軸突末梢鈣信號的發(fā)放與探索活動有很好的對應(yīng)關(guān)系;探索動作的發(fā)出與軸突末梢鈣信號發(fā)放起點的潛伏期平均約318 ms;小鼠在滾輪上的單純跑動，梳理毛發(fā)與吃食物等行為的鈣信號強度明顯低于自由探索對應(yīng)的鈣信號;切斷視覺輸入后，軸突末梢的探索鈣信號幅值顯著降低;小鼠對新物體的探索鈣信號強度高于對熟悉物體的探索;小鼠在饑餓狀態(tài)下的探索鈣信號強度高于飽食狀態(tài)。(4)四通道光纖系統(tǒng)的四個通道可以同時記錄MECⅡ-DG

7、軸突末梢4個不同位點的鈣信號;MECⅡ-DG軸突末梢4個記錄位點的空間探索鈣信號高度同步化;MECⅡ-DG軸突末梢某些位點對空間探索的功能編碼有較強的空間方位選擇傾向(57％)，但也存在一些空間方位選擇傾向較差的位點(43％);空間方位選擇傾向較好與較差的位點數(shù)呈散在分布。
　　結(jié)論:(1)利用AAV病毒成功建立了MECⅡ-DG連接通路的功能學(xué)標記方法。(2)通過光纖探測系統(tǒng)建立了在清醒自由探索小鼠的MECⅡ-DG軸突末梢長期穩(wěn)定