PI3K介導(dǎo)ephrinBs-EphBs信號(hào)相關(guān)的脊髓傷害性信息的調(diào)制.pdf

1、目的：
　　 EphBs受體及ephrinBs配體存在于成年的大腦及組織中，在各種病理過(guò)程、生理功能中具有重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，ephrinBs作為致敏物質(zhì)，通過(guò)激活中樞ephrinBs/EphBs信號(hào)系統(tǒng)引起中樞敏感化和痛覺(jué)過(guò)敏，但是機(jī)制尚未明了。PI3K涉及眾多生理功能和病理過(guò)程的調(diào)節(jié)。研究證明PI3K信號(hào)通路參與傷害性信息調(diào)制，介導(dǎo)傷害刺激引起的中樞敏感化，如介導(dǎo)NGF/TrkA和GDNF/Ret信號(hào)激活引起的中樞敏感

2、化和痛覺(jué)過(guò)敏等。其他研究領(lǐng)域已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)EphBs受體參與調(diào)節(jié)PI3K的激活。本研究目的是證明PI3K是否參與介導(dǎo)中樞脊髓ephrinBs/EphBs信號(hào)激活引起的痛行為。
　　 方法：
　　 ①為觀察鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc是否引起時(shí)間和劑量依賴性的痛覺(jué)過(guò)敏，鞘內(nèi)注射不同劑量ephrinBl-Fc(0.02，0.1，0.5μg，溶于10μl生理鹽水中)，注射后30min，1，2，4，8，24，48h檢測(cè)熱縮足反射

3、潛伏期及機(jī)械縮足反射閾值；為觀察鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc是否引起劑量依賴性的脊髓背角神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)，鞘內(nèi)注射不同劑量的ephrinBl-Fc(0.02，0.1，0.5μg)，注射后2h，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)脊髓背角神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)。
　　 ②為觀察鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc是否時(shí)間依賴性激活脊髓PI3K及其下游信號(hào)蛋白磷酸化AKT，鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc0.5μg/10μl后分別于10min、30

4、min、1h、4h及8hN間點(diǎn)取注射部位脊髓，用蛋白電泳檢測(cè)鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc引起相應(yīng)注射部位脊髓PI3K-p110γ及P-AKT表達(dá)變化的時(shí)間相；為觀察鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc是否劑量依賴性激活脊髓PI3K及其下游信號(hào)蛋白磷酸化AKT，鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc0.02μg、0.1μg、0.5μg/10μl，30min后，用蛋白電泳檢測(cè)鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc引起相應(yīng)注射部位脊髓PI3K-p110γ及p-A

5、KT表達(dá)變化；為觀察鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc引起AKT的激活是否通過(guò)PI3K介導(dǎo)，鞘內(nèi)注射PI3K抑制劑wortmannin0.4μg/10μl或LY2940025μg/10μl預(yù)處理，30min后同一部位鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc0.5μg/10μl，再30min后用蛋白電泳檢測(cè)相應(yīng)注射部位脊髓p-AKT表達(dá)變化。
　　 ③為觀察PI3K抑制劑對(duì)ephrinBl-Fc引起的痛行為的影響。鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc

6、0.5μg/10μl，前30min(預(yù)處理)或后30min(后處理)鞘內(nèi)注射PI3K抑制劑wortmannin0.016、0.08、0.4μg/10μl和LY2940020.2、1、5μg/10μl，檢測(cè)預(yù)處理組最后一次注射后0.5h、1h、2h、4h、8h、24h及48h和后處理組最后一次注射后0.5h、1h、2h、4h、8h的熱縮足反射潛伏期、機(jī)械縮足反射閾值；為觀察PI3K抑制劑對(duì)ephdrdBl-Fc引起的脊髓背角神經(jīng)元Fos蛋

7、白表達(dá)的影響，PI3K抑制劑wortmannin0.4μg/10μl和LY2940025μg/10μl預(yù)處理30min或后處理30min，檢測(cè)最后一次注射后2h腰4、5脊髓背角神經(jīng)元Fos蛋白的表達(dá)。
　　 ④為觀察EphB受體是否參與福爾馬林引起的中樞PI3K的激活。在注射福爾馬林(1％，10μl)前30分鐘，鞘內(nèi)注射EphB受體阻斷劑EphBl-Fc(0.5μg)，記錄注射福爾馬林后0～5min和15～30min的累積舔足時(shí)

8、間和縮足反應(yīng)次數(shù)，蛋白電泳檢測(cè)福爾馬林注射后30min脊髓PI3K和p-AKT表達(dá)，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)2h后脊髓背角神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)。
　　 ⑤為觀察EphB受體是否參與神經(jīng)病理性疼痛引起的中樞PI3K的激活。EphB受體阻斷劑EphBl-Fc(0.5μg)在CCI模型建立前后鞘內(nèi)給藥3次(CCI前1h，后1d，3d)(預(yù)處理)或單次鞘內(nèi)給藥(CCI后5d)(后處理)，檢測(cè)多次給藥組CCI模型建立后1d、3d、5d、7d和

9、單次給藥組CCI模型建立后1d、3d、5d(給藥后0.5h、1h、2h、4h、8h)、6d、7d的熱縮足反射潛伏期、機(jī)械縮足反射閾值，蛋白電泳檢測(cè)多次給藥組CCI模型建立后5d和單次給藥組給藥后2h脊髓PI3K和p-AKT表達(dá)，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)多次給藥組CCI模型建立后5d和單次給藥組給藥后2h脊髓背角神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)。
　　 ⑥為觀察PI3K在ephrinBl-Fc引起的注射部位脊髓ERK激活中的作用。PI3K抑制劑w

10、ortmannin0.4μg/10μl或LY2940025μg/10μl鞘內(nèi)注射30min后(預(yù)處理)，鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc0.5μg/10μl，30min后使用蛋白電泳法檢測(cè)相應(yīng)注射部位脊髓P-ERK的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 ①鞘內(nèi)注射EphBs受體激動(dòng)劑ephrinBl-Fc，小鼠的熱縮足反射潛伏期及機(jī)械縮足反射閾值呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性降低，30min即可檢測(cè)到明顯降低，2h達(dá)到最低值，降低過(guò)程至少

11、持續(xù)到24h，48h后趨于正常；鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc后相應(yīng)注射部位脊髓背角神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)呈劑量依賴性增加。
　　 ②鞘內(nèi)注射ephrinBl-Fc后相應(yīng)注射部位脊髓PI3K-p110γ表達(dá)呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性增加，10min即可檢測(cè)到明顯增加，30min達(dá)到最高峰，8h恢復(fù)基礎(chǔ)水平；p-AKT表達(dá)呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性增加，1h達(dá)到最高峰，持續(xù)至少8h；PI3K抑制劑wortmannin或LY294002預(yù)

12、處理能阻斷ephrinBl-Fc引起的注射部位脊髓p-AKT表達(dá)的增加。
　　 ③PI3K抑制劑wortmannin或LY294002預(yù)處理或后處理能部分防止或逆轉(zhuǎn)ephrinBl-Fc鞘內(nèi)注射引起的熱、機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏，并且隨劑量的增加抑制程度增加；PI3K抑制劑wortmannin或LY294002預(yù)處理或后處理能防止或逆轉(zhuǎn)ephrinBl-Fc鞘內(nèi)注射引起的脊髓背Fos蛋白表達(dá)的增加。
　　 ④Eph受體阻斷劑EphB

13、l-Fc預(yù)處理能夠減少福爾馬林引起的舔足時(shí)間，縮足反應(yīng)次數(shù)及脊髓Fos蛋白、PI3K和p-AKT表達(dá)。
　　 ⑤Eph受體阻斷劑EphBl-Fc預(yù)處理或后處理能夠部分逆轉(zhuǎn)神經(jīng)病理性疼痛引起的熱、機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏及脊髓Fos蛋白、PI3K和p-AKT表達(dá)。
　　 ⑥PI3K抑制劑wortmannin或LY294002預(yù)處理防止ephrinBl-Fc鞘內(nèi)注射引起的相應(yīng)注射部位脊髓p-ERK表達(dá)增加，并且呈劑量依賴性抑制。