利用羊膜上皮干細(xì)胞抑制皮膚增生性瘢痕形成的研究.pdf

1、病理性瘢痕是皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程中異常增生所致，主要包括增生性瘢痕（Hypertrophic Scar，HS）和瘢痕疙瘩（Keloid，K）。兩者組織學(xué)特點(diǎn)都是成纖維細(xì)胞增值，細(xì)胞外基質(zhì)過度分泌、膠原過度沉積。臨床表現(xiàn)為瘙癢、疼痛、嚴(yán)重可導(dǎo)致關(guān)節(jié)的功能障礙等。目前增生性瘢痕的發(fā)生機(jī)制尚不明確，且臨床治療復(fù)雜及困難。所以對抑制皮膚瘢痕形成的研究就尤為重要。
　　研究表明瘢痕的形成因素之一是多種炎性因子參與的病理過程，使正常的創(chuàng)面愈合結(jié)果

2、變?yōu)轳：鄣男纬?。文獻(xiàn)報道，Gordon等利用小鼠傷口組織，采用腺病毒介導(dǎo)的IL-10轉(zhuǎn)染的方法，證實(shí)過表達(dá)的IL-10可以明顯的抑制傷口炎癥反應(yīng)，從而減少瘢痕的形成，進(jìn)一步驗(yàn)證了抗炎癥策略在防止瘢痕的形成，以及治療中具有重要作用。
　　羊膜是胎膜的一部分，包括來源于胚胎外胚層的上皮細(xì)胞（Human amniotic epithelial cells,hAECs）和胚胎中胚層的間質(zhì)細(xì)胞（Human amniotic mesenchy

3、mal cells,hAMCs），羊膜上皮細(xì)胞具有部分干細(xì)胞特性，可分化為三個胚層不同類型的細(xì)胞?，F(xiàn)臨床以成功的應(yīng)用在眼科，利用羊膜上皮細(xì)胞的干細(xì)胞特性，通過抑制炎癥反應(yīng)治療角膜潰瘍和翼狀胬肉等疾病。
　　本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建兔耳瘢痕模型，利用羊膜上皮干細(xì)胞抑制炎癥因子、免疫源性極低等優(yōu)點(diǎn)，在創(chuàng)面周圍定期注射羊膜上皮干細(xì)胞懸液，研究羊膜上皮干細(xì)胞抑制瘢痕形成中所起的作用。為增生性瘢痕的防治和治療開辟一條新的道路。
　　第一部分實(shí)驗(yàn)

4、：羊膜上皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　1.主要方法：
　　從胎膜組織中分離羊膜組織，采用胰蛋白消化法、LG-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的羊膜上皮細(xì)胞分別進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光染色、成骨成脂多向分化等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行干細(xì)胞特性的鑒定。
　　2.主要結(jié)果：
　　FCM結(jié)果顯示不同程度的陽性表達(dá)CD29、CD90、CD105，CD34、CD45為陰性。其中陽性率最高的是CD29，說明羊膜上皮細(xì)胞兼有間充質(zhì)干細(xì)胞的表型

5、特征。免疫熒光染色顯示SSEA-4，Oct-4均有陽性表達(dá)。hAECs成功定向誘導(dǎo)成脂成骨。
　　3.主要結(jié)論：
　　羊膜上皮細(xì)胞具有一般干細(xì)胞的特性。
　　第二部分實(shí)驗(yàn)：瘢痕成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)
　　1.主要方法：
　　取外科手術(shù)中廢棄的增生性瘢痕組織，采用組織快培養(yǎng)法、DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。
　　2.主要結(jié)果：
　　原代培養(yǎng)時間較長，大約1周時間有少許細(xì)胞從組織塊周圍爬出，生長較快，鏡下觀察

6、，細(xì)胞為長梭形，較正常皮膚成纖維細(xì)胞略短。
　　3.主要結(jié)論：
　　成功的培養(yǎng)出瘢痕的成纖維細(xì)胞。
　　第三部分實(shí)驗(yàn)：羊膜上皮細(xì)胞與瘢痕成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)及鑒定
　　1.主要方法：
　　將羊膜上皮細(xì)胞種于6孔板中，待完全貼壁時，3個孔放入Transwell,另外3個孔為對照，將瘢痕成纖維細(xì)胞種于Transwell中,加入IL-6炎性因子刺激下，讓兩種細(xì)胞共同培養(yǎng)，分別在共培養(yǎng)的1、2、3天提取RNA，進(jìn)行細(xì)

7、胞周期、細(xì)胞凋亡及PCR檢測。
　　2.主要結(jié)果：
　　細(xì)胞周期結(jié)果顯示1d，3d的實(shí)驗(yàn)組中瘢痕成纖維細(xì)胞增殖要低于對照組，說明羊膜上皮細(xì)胞對瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖有抑制作用。細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示1d、3d實(shí)驗(yàn)組瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡的比對照組數(shù)值略高。PCR檢測顯示，實(shí)驗(yàn)組的OCT-4、Ι型膠原較對照組高，而TIMP-1低于對照組。
　　3.主要結(jié)論：
　　兩種細(xì)胞共培養(yǎng)后，羊膜上皮細(xì)胞對瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡有作用

8、，PCR檢測TIMP-1、OCT-4、Ι型膠原等指標(biāo)隨著時間不同各自的表達(dá)不同。
　　第四部分實(shí)驗(yàn)：利用動物模型檢測羊膜上皮細(xì)胞在瘢痕防治中的作用
　　1.主要方法：
　　手術(shù)切除雙側(cè)兔耳內(nèi)側(cè)面，形成直徑為1×1cm的4個方形全層皮膚缺損；在右耳創(chuàng)面周圍注射羊膜上皮細(xì)胞懸液，左耳創(chuàng)面周圍注射PBS緩沖液。每周注射一次，定期觀察。4周后實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面完全上皮化，腫塊較小。對照組腫塊明顯。取瘢痕組織進(jìn)行HE染色及激光共聚焦觀察

9、。
　　2.主要結(jié)果：
　　HE染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組上皮化完全、略顯增生狀態(tài)，基底層細(xì)胞排列明顯，其下的真皮組織中未見炎性細(xì)胞分布，成纖維細(xì)胞分布與對照組相比較為分散。共聚焦可觀察到移植的羊膜上皮細(xì)胞。對照組HE染色顯示成纖維細(xì)胞分布集中，增生明顯。共聚焦未見羊膜上皮細(xì)胞。
　　3.主要結(jié)論：
　　通過肉眼觀察、HE染色及共聚焦檢測，說明羊膜上皮干細(xì)胞有效的抑制瘢痕的形成。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)利用羊膜上皮細(xì)