褐飛虱紅色復(fù)眼的突變機理研究.pdf

1、褐飛虱（Brown planthopper，BPH），Nilaparvata lugens Stal，屬半翅目飛虱科，是亞洲許多地區(qū)水稻上的重要害蟲之一。褐飛虱正常眼色為褐色，在室內(nèi)長期飼養(yǎng)的農(nóng)藥敏感品系中偶見紅眼突變體。作為可見的遺傳標(biāo)記，褐飛虱紅眼突變體具有多種潛在應(yīng)用價值。明確突變體的生物學(xué)特征及突變機理將有助于此突變體應(yīng)用價值的探索。
　　前期研究結(jié)果表明，紅眼表型受常染色體上一對隱性等位基因的調(diào)控，其眼黃素含量僅為野生型

2、個體的36.3％，色素顆粒數(shù)量及電子致密度也顯著下降。為了靶標(biāo)基因的準確定位，本研究首先構(gòu)建了褐飛虱褐眼野生型和紅眼突變型近等基因系，然后以近等基因系為材料從基因及蛋白水平對褐飛虱紅眼突變的機理進行了研究。主要研究結(jié)果如下:
　　1.褐飛虱紅眼突變體的種群參數(shù)比較
　　本部分首先通過1代雜交和8代自交試驗篩選了褐飛虱紅眼突變型和褐眼野生型的近等基因系，命名為NIL-rr和NIL-BB。生物學(xué)試驗結(jié)果表明，NIL-BB的生存力

3、及繁殖力顯著下降，而NIL-rr和普通的室內(nèi)褐眼種群(BB)相似。其中，NIL-BB的單雌產(chǎn)卵量及卵孵化率兩參數(shù)的顯著降低是其種群適合度下降的主要原因。BB、NIL-rr和NIL-BB的種群趨勢指數(shù)分別為52.18、43.80和4.19。另外，NIL-rr品系初羽化雌成蟲的體重和體長也顯著重/長于NIL-BB品系。相對于NIL-BB，NIL-rr較強的繁殖力及較大的體型可能是因為眼色突變基因或其緊密連鎖基因?qū)Ψ敝尘哂休^強的補償作用。本研

4、究結(jié)果表明，NIL-rr并不具有生態(tài)風(fēng)險，或可用作田間研究材料。意外獲得的具有較低繁殖力和生命力的NIL-BB品系試蟲可用作生殖相關(guān)信號通路的研究模型。
　　2.褐飛虱眼色相關(guān)基因的克隆
　　為了進一步定位突變基因，本部分在前期獲得的4個基因片段的基礎(chǔ)上，進一步利用生物信息學(xué)、熱啟動PCR和RACE技術(shù)克隆了10個眼色相關(guān)基因，其中有7個基因通過RACE技術(shù)獲得了全長序列，包括5'-和3'-UTR，有3個基因還未獲得全長序列

5、。同源比對表明，這些基因都與其他昆蟲的直系同源物具有較高的一致性，也存在典型的特征序列，因此認為它們編碼蛋白就是相對應(yīng)果蠅眼黃素合成通路的色氨酸加氧酶（vermilion）、犬尿氨酸甲酰胺酶、犬尿氨酸羥化酶(cinnabar)和酚額嗪酮合成酶（karmoisin），色素轉(zhuǎn)運通路的White（white）和Scarlet(scarlet)半轉(zhuǎn)運子，色素顆粒形成通路的接頭蛋白復(fù)合體AP3的4個亞基(garnetcarmine/ruby/or

6、ange)。本部分的研究結(jié)果為篩選變異靶標(biāo)基因奠定了基礎(chǔ)。
　　3.眼色基因變異位點的篩進
　　為了尋找導(dǎo)致褐飛虱復(fù)眼眼色變異的分子機理，即突變位點，本研究對野生型和突變型近等基因系的10個眼色相關(guān)基因的編碼區(qū)分別進行了克隆和對比分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有紅眼突變個體的犬尿氨酸羥化酶(KMO)編碼基因Nlkmo都存在三個同義突變位點、一個異義突變位點(L49I)和一個5堿基的插入突變位點。閱讀框內(nèi)5堿基的插入，使氨基酸翻譯提前終止，

7、缺少了115個氨基酸殘基，破壞了兩個跨膜螺旋。
　　4.Nlkmo基因的眼色決定作用驗證
　　前人已證明，KMO在雙翅目的果蠅和蚊子、鱗翅目的家蠶復(fù)眼著色過程中起關(guān)鍵作用，但其對半翅目昆蟲復(fù)眼著色過程的影響還不明確。本章對褐飛虱野生型品系3齡若蟲注射KMO雙鏈RNA(dsKMO)后，Nlkmo表達水平顯著下降，復(fù)眼眼色部分變?yōu)榧t色，且眼黃素也下降為對照個體的55.3％。這表明，同其他昆蟲一樣，褐飛虱KMO也是褐飛虱眼黃素合成

8、通路關(guān)鍵酶之一。此結(jié)果還說明，Nlkmo作為標(biāo)記基因可用于褐飛虱及相近昆蟲的卵期RNAi技術(shù)的研發(fā)。
　　5.Nlkmo基因的時空表達特征及其在突變體中的表達變化
　　為了深入了解褐飛虱Nlkmo基因的分子特性，本部分測定了其時空表達特征，并對比分析了其在紅眼突變體中的表達變化。Nlkmo基因在所有生育期及組織內(nèi)都有表達，包括卵、若蟲、成蟲、卵巢、中腸、馬氏管、體壁和脂肪體。Nlkmo轉(zhuǎn)錄本水平在NIL-BB和NIL-rr兩

9、品系間并無顯著差異，推斷Nlkmo存在的一個異義突變位點和一個5nt的插入位點并不影響轉(zhuǎn)錄本水平，可能是在蛋白質(zhì)翻譯及修飾階段對眼色產(chǎn)生影響。
　　6.Nlkmo編碼蛋白的催化活性分析
　　本章首先提取NIL-BB和NIL-rr兩品系褐飛虱頭部的總蛋白，分別命名為KMO-BB和KMO-rr。利用液相色譜技術(shù)測定了兩種總蛋白轉(zhuǎn)化犬尿氨酸(KYN)為3-羥基犬尿氨酸(3-HK)的催化活性。結(jié)果表明，KMO-BB的催化活性約為KM

10、O-rr的9.03倍。為了精準分析，本章利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)對野生型和突變型KMO酶進行了外源表達，分別命名為rKMO-BB和rKMO-rr,其中rKMO-rr未引入點突變位點(L49I)，只引入了5堿基的插入突變位點。利用相同方法測定重組蛋白的催化活性，結(jié)果表明，rKMO-BB的活性遠遠高于KMO-BB，而rKMO-rr的活性小于KMO-rr,以致未能檢測到。以上結(jié)果說明，Nlkmo既是褐飛虱紅眼突變表型產(chǎn)生的靶標(biāo)基因，而5堿基的