脂聯(lián)素促進(jìn)2型糖尿病小鼠骨骼肌支鏈氨基酸分解及其機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：
　　糖尿病尤其是2型糖尿病(type2 diabetes mellitus,T2DM)的發(fā)病率和病死率日趨上升。2013年我國(guó)糖尿病患者人數(shù)為1.14億;到2035年,中國(guó)的糖尿病患病人數(shù)將達(dá)到1.43億。2型糖尿病已經(jīng)成為危害人類健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的全球性問(wèn)題,其成為繼癌癥、心血管疾病之后威脅人類健康的第三大疾病。進(jìn)一步明確糖尿病發(fā)病機(jī)制,并尋求更為有效的防治措施已經(jīng)刻不容緩。骨骼肌是胰島素主要靶器官之一,其在胰島素

2、抵抗發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。大量研究顯示,肥胖、代謝綜合征和2型糖尿病患者表現(xiàn)為逐漸升高的血漿支鏈氨基酸（branched-chain amino acids,BCAA)水平,且血漿BCAA水平與肥胖患者胰島素抵抗密切相關(guān)。Newgard等人研究發(fā)現(xiàn),高脂誘導(dǎo)的小鼠骨骼肌中BCAA顯著升高,但其原因尚不完全清楚。
　　BCAA包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸,屬于人體營(yíng)養(yǎng)必需氨基酸,食物是BCAA的主要來(lái)源。BCAA不僅是機(jī)體重要的能

3、源物質(zhì),在各種特定條件下氧化分解,釋放能量;還是其它多種具有重要生物活性物質(zhì)如蛋白質(zhì)、激素、酮體等的合成源料。更為重要的是,它還可作為重要的信號(hào)分子,通過(guò)雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)等途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝。人體主要依賴調(diào)節(jié)BCAA分解代謝維持其含量的穩(wěn)態(tài)。骨骼肌是 BCAA分解代謝的“場(chǎng)所”之一,在限速酶支鏈α酮酸脫氫酶(branched-chain alpha keto a

4、cid dehydrogenase,BCKD)復(fù)合物的催化作用下,BCAA生成相應(yīng)的脂酸并進(jìn)入三羧酸循環(huán)或轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌锘钚晕镔|(zhì)。BCKD復(fù)合物的活性取決于其E1α亞基絲氨酸293位點(diǎn)的磷酸化(失活)和去磷酸化(激活)狀態(tài)。但是,2型糖尿病動(dòng)物骨骼肌BCAA水平升高是否與BCKD活性改變有關(guān)及其分子機(jī)制,目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。
　　脂聯(lián)素(Adiponectin,APN)是由脂肪細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子。眾多的研究證實(shí),脂聯(lián)素具有廣泛的

5、生物學(xué)作用,包括調(diào)節(jié)糖脂代謝、抑制炎癥反應(yīng)/保護(hù)血管、抗缺血心肌保護(hù)作用。研究還證實(shí),脂聯(lián)素能夠通過(guò)過(guò)氧化物酶增殖物受體、Rab5和腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)等信號(hào)通路發(fā)揮其調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用。其中,AMPK是脂聯(lián)素最為重要的下游信號(hào)分子,AMPK介導(dǎo)脂聯(lián)素的胰島素增敏、心肌及血管保護(hù)、糖脂代謝調(diào)節(jié)等作用。然而,脂聯(lián)素是否參與骨骼肌BC

6、AA分解代謝;AMPK是否介導(dǎo)脂聯(lián)素調(diào)節(jié)BCAA代謝尚不清楚。
　　研究目的：
　　1.制備2型糖尿病小鼠模型,觀察其骨骼肌BCAA的代謝情況。
　　2.明確脂聯(lián)素能否調(diào)節(jié)2型糖尿病小鼠骨骼肌BCAA分解代謝。
　　3.探討脂聯(lián)素調(diào)節(jié)2型糖尿病小鼠骨骼肌BCAA分解代謝的分子機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.用低劑量鏈脲菌素(streptozocin,STZ)和高脂飲食誘導(dǎo)的方法建立T2DM模型。每天監(jiān)

7、測(cè)小鼠隨機(jī)血糖,第12周時(shí)采用IPGTT法檢測(cè)葡萄糖耐量,采用ELISA方法檢測(cè)血漿胰島素水平。
　　2.采用ELISA方法檢測(cè)野生型(WT)、小鼠、ob/ob小鼠及T2DM小鼠,APN治療前后其骨骼肌中BCAA水平變化情況。
　　3.采用 ELISA方法檢測(cè) WT、APN-/-、WT+HD(高脂誘導(dǎo))、APN-/-+HD、APN-/-+HD+APN組小鼠骨骼肌 BCAA水平。以及 Western blot法檢測(cè)P-BCKD

8、E1α/BCKDE1α水平。
　　4.分別給予誘導(dǎo)的T2DM小鼠PBS對(duì)照、APN(5 mg/kg體重)、AICAR(200 mg/kg體重)及APN(5 mg/kg體重)+CC(20 mg/kg體重)治療3天4次。采用ELISA方法檢測(cè)小鼠骨骼肌 BCAA水平、Western blot法檢測(cè)骨骼肌 P-AMPK/AMPK和P-BCKDE1α/BCKDE1α水平。
　　5.將高BCAA培養(yǎng)的骨骼肌成肌細(xì)胞系(C2C12細(xì)胞)

9、分為:正常對(duì)照(vehicle)及APN(5μg/ml)組。檢測(cè)給予APN治療后采用ELISA方法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)(0 min、30 min、1 h、3 h、24 h)時(shí)上清中的BCAA水平,采用 Western blot法檢測(cè)P-AMPK/AMPK及P-BCKDE1α/BCKDE1α水平。
　　6.培養(yǎng)的C2C12細(xì)胞,高 BCAA孵育后分為4組:正常對(duì)照(vehicle)、APN(5μg/mL)、AICAR(20μmol/L)及

10、APN(5μg/mL)+CC(50μmol/L)組。藥物治療后1 h ELISA方法檢測(cè)各組上清中 BCAA水平、Western blot法檢測(cè)細(xì)胞P-AMPK/AMPK及P-BCKDE1α/BCKDE1α水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.檢測(cè)小劑量STZ+高脂飲食誘導(dǎo)小鼠的隨機(jī)血糖、血漿胰島素,行IPGTT試驗(yàn),將血糖水平升高、血漿胰島素水平升高、葡萄糖耐受不良者視為T2DM建模成功。
　　2.檢測(cè)了WT、ob/ob及

11、T2DM組小鼠骨骼肌中的BCAA水平,結(jié)果顯示T2DM及ob/ob組小鼠骨骼肌中BCAA水平明顯高于正常組。給予各組小鼠脂聯(lián)素腹腔注射5mg/kg,1次/日,連續(xù)3日4次治療,末次注射后1 h取骨骼肌,檢測(cè)BCAA水平。結(jié)果顯示APN治療后T2DM與ob/ob組骨骼肌BCAA水平顯著降低,說(shuō)明脂聯(lián)素可以降低2型糖尿病小鼠骨骼肌中BCAA的水平。
　　3.檢測(cè) WT、WT+HD、APN-/-、APN-/-+HD組小鼠骨骼肌內(nèi) BCA

12、A及P-BCKDE1α/BCKDE1α水平,結(jié)果顯示: WT、WT+HD組無(wú)差異,與 APN-/-組相比,APN-/-+HD組骨骼肌BCAA水平明顯均升高、P-BCKDE1α/BCKDE1α水平也升高,提示APN-/-+HD組小鼠骨骼肌中支鏈氨基酸分解的限速酶活性降低導(dǎo)致BCAA水平升高;檢測(cè)APN-/-+HD以及APN-/-+HD+APN組BCAA及P-BCKDE1α/BCKDE1α水平發(fā)現(xiàn),與APN-/-+HD組相比較,APN-/-

13、+HD+APN組骨骼肌P-BCKDE1α/BCKDE1α明顯下降,BCAA水平也下降,因此可以得出結(jié)論,脂聯(lián)素治療,上調(diào)BCKD酶的活性、進(jìn)一步下調(diào)2型糖尿病小鼠骨骼肌BCAA的水平。
　　4.我們分別給予T2DM小鼠PBS對(duì)照、APN(5 mg/kg體重)、AICAR(200 mg/kg體重)及APN(5 mg/kg體重)+CC(20 mg/kg體重)治療3天4次后,檢測(cè)骨骼肌BCAA水平、P-BCKDE1α/BCKD E1α、

14、P-AMPK/AMPK水平。結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,AICAR和APN組骨骼肌中BCAA、P-BCKDE1α/BCKD E1α水平均下降、P-AMPK/AMPK水平升高,這說(shuō)明增強(qiáng)AMPK活性能夠增強(qiáng)骨骼肌BCKD E1α酶活性、促進(jìn)BCAA的分解、除低骨骼肌BCAA水平。而與APN組相比,APN+CC組骨骼肌P-AMPK/AMPK降低、P-BCKD E1α/BCKD E1α、BCAA的水平升高,提示給予AMPK抑制劑抑制AMPK活性,

15、APN失去了上調(diào)T2DM小鼠骨骼肌BCKD E1α活性,促進(jìn)其骨骼肌BCAA分解代謝的作用。
　　5.與對(duì)照組相比,給予脂聯(lián)素后30min開始,其上清中BCAA水平即開始下降,1 h時(shí)下降最明顯,直到3h仍有下降,24 h時(shí)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組相比,P-AMPK/AMPK水平給藥后30min、1h和3h,P-AMPK/AMPK的水平均升高,P-BCKD E1α/BCKD E1α給藥后30min、1h和3h下降。提示APN可以上調(diào)

16、AMPK及BCKD活性,促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞對(duì)上清中BCAA的分解,而且,從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知,APN治療1h是BCAA水平下降最為顯著的時(shí)間。
　　6.我們用藥理學(xué)手段,將高BCAA培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞分為對(duì)照、APN(5μg/mL)、AICAR(20μmol/L)以及APN+CC(50μmol/L)組。分別給藥處理1 h,結(jié)果顯示給予AICAR或APN組上清BCAA較正常組明顯降低,P-BCKDE1α/BCKDE1α水平也下降;而與單純

17、脂聯(lián)素組相比較,APN+CC組上清 BCAA及P-BCKDE1α/BCKDE1α水平均升高。進(jìn)一步提示,離體培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞上,APN可以直接通過(guò)激活A(yù)MPK調(diào)節(jié)高BCAA培養(yǎng)的BCAA代謝,而且APN調(diào)節(jié)骨骼肌細(xì)胞BCAA分解代謝獨(dú)立于其糖脂調(diào)節(jié)作用之外。
　　結(jié)論：
　　1.2型糖尿病時(shí)脂聯(lián)素水平降低是骨骼肌BCAA分解代謝異常的可能原因。
　　2.獨(dú)立于脂聯(lián)素改善糖脂代謝作用,脂聯(lián)素通過(guò)AMPK參與2型糖尿病骨骼