Megsin基因?qū)μ悄虿⌒∈竽I組織ERK5MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響的研究.pdf

1、目的:糖尿病(diabetes mellitus,DM)及其并發(fā)癥已經(jīng)成為一個公眾健康問題。糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常見和最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一,它己成為終末期腎功能衰竭(end-stage renalfailer,ESRF)的主要原因之一。盡管我們對糖尿病腎病做了大量的研究,但是腎臟損傷發(fā)生和發(fā)展的確切機(jī)制目前尚不清楚,因此探索糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制及防治策略已成為目前廣大腎臟病學(xué)者迫切關(guān)

2、注的課題。
　　 DN是多因素綜合作用引起的疾病,目前認(rèn)為,其發(fā)病機(jī)制可能與糖代謝紊亂及由此所致的非酶糖基化、蛋白激酶C激活、多元醇通路激活、高血壓所致的腎血流動力學(xué)改變、脂代謝紊亂、血管活性物質(zhì)、氧化應(yīng)激及遺傳因素、細(xì)胞因子等多因素有關(guān)。Megsin基因與蛋白的表達(dá)上調(diào)在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中的作用目前已受到國內(nèi)學(xué)者的關(guān)注。Megsin是一種系膜細(xì)胞優(yōu)勢表達(dá)基因,測試分析顯示其屬絲氨酸蛋白酶抑制劑(seprin)超家族的一員,特

3、異表達(dá)于人、大鼠及小鼠的系膜細(xì)胞中,具有重要的功能。其適量的表達(dá)對維持人體正常的生理病理過程和體內(nèi)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)平衡是必需的,這些病理生理過程包括凝血、纖維蛋白降解、細(xì)胞外基質(zhì)代謝、細(xì)胞分化、增殖與凋亡、發(fā)育、血壓、腫瘤和炎癥等。探討megsin在糖尿病小鼠的腎組織中作用對于揭示糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制具有非常重要的意義。故進(jìn)一步研究megsin與ERK5MAPK之間的相關(guān)性在腎病中的作用,也許能為糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制和防治提供一些實(shí)驗(yàn)性的依據(jù)。

4、
　　 本課題建立糖尿病小鼠的模型是通過鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)并通過尾靜脈質(zhì)粒注射的方法,將空質(zhì)粒、megsin質(zhì)粒及megsin-siRNA質(zhì)粒經(jīng)由小鼠尾靜脈注入糖尿病小鼠體內(nèi),以此分成四組,正常對照組為單側(cè)腎臟切除組,對不同組腎臟病變程度進(jìn)行觀察,并采用免疫組織化學(xué)染色和蛋白印跡(western-blot)方法檢測不同組megsin、ERK5、TGF-β和FN之間的關(guān)系,研究探索megsin參

5、與DN發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制,可能為臨床治療糖尿病腎病提供新的干預(yù)途徑和方法。
　　 方法:
　　 選取清潔級健康雄性12周齡CD-1小鼠,共60只,切除單側(cè)腎臟,隨機(jī)抽取48只腹腔注射STZ(溶于0.1mol/L檸檬酸緩沖液,濃度為2％,pH值為4.5,注射劑量150mg/kg)制備糖尿病小鼠模型,48小時后測定血糖及尿糖,血糖≥16.7mmol/L并且尿糖持續(xù)陽性確定為糖尿病小鼠模型,將檢測成模的48只糖尿病小鼠隨機(jī)分為糖

6、尿病組(B組)、糖尿病+空質(zhì)粒組(C組)、糖尿病+megsin質(zhì)粒組(D組)和糖尿病+siRNAmegsin質(zhì)粒組(E組),每組12只,正常對照組(A組)為只做單側(cè)腎臟切除的12只小鼠,采用尾靜脈注射的方法導(dǎo)入質(zhì)粒載體,每周注射1次，小鼠在整個實(shí)驗(yàn)期間自由飲食,不應(yīng)用胰島素及其它降糖藥物。實(shí)驗(yàn)開始后12周末收集尿、血及腎組織標(biāo)本,檢測24小時尿蛋白定量、血肌酐及腎重/體重比值;石蠟切片行HE、PAS和MASSON染色,觀察腎小球的病理改

7、變,免疫組化和蛋白印跡(Western-blot)方法檢測megsin、ERK5、TGF-β和FN的表達(dá)情況,結(jié)果用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示,方差齊性檢驗(yàn)用Levene法,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用單因素方差分析,組間差異顯著性檢驗(yàn)采用LSD或Tamhane's test,顯著性水平等于0.05,應(yīng)用SPSS13.0軟件包對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　 結(jié)果:
　　 1：在注射STZ4～5天后,B組、C組、D組、E組小鼠出現(xiàn)了

8、多飲、多食、多尿的表現(xiàn),組間無明顯差異,而A組無多飲、多食、多尿出現(xiàn)。在12周末,B組及C組小鼠Scr、KW/BW和UP較A組升高(P＜0.01),D組升高更明顯(P,＜0.01),E組KW/BW和UP較B、C組下降(P＜0.01)。
　　 2：光鏡HE顯示2周和4周末C組與B組腎小球內(nèi)系膜細(xì)胞增生,基質(zhì)增多,系膜區(qū)增寬,基底膜增厚相比無顯著性(P＞0.05),B組和C組較A組增多,差異有顯著性(P＜0.01),D組增多更顯著,

9、差異有顯著性(P＜0.01),12周末B組、C組和D組小鼠系膜細(xì)胞增生,基質(zhì)增多,系膜區(qū)增寬,基底膜增厚,高于A組,差異有顯著性(p＜0.01),E組少于同期B組和C組,有顯著差異性(p＜0.05);光鏡HE、PAS、MASSON染色顯示,第12周末B組和C組。腎小球體積增大,系膜細(xì)胞增生,基質(zhì)增多,系膜區(qū)增寬,基底膜增厚,E組較B、C組病變減輕,D組病變最嚴(yán)重。
　　 3：免疫組化和western blot結(jié)果顯示:2周末B、

10、C組megsin、ERK5、TGF-β和FN表達(dá)增強(qiáng),D組變化更顯著,E組較B、C組表達(dá)減弱,組間差異有顯著性意義(p＜0.01);4周末上述各指標(biāo)變化更為明顯,組間比較有顯著性差異(p＜0.01);12周末B、C組ERK5表達(dá)水平下降但仍高于A組和E組,弱于D組(p＜0.01,p＜0.05),其他指標(biāo)如megsin、TGF-β和FN表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng),D組增多更明顯,E組表達(dá)較B、C減少(p＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　

11、 1：糖尿病小鼠中megsin和ERK5在腎組織表達(dá)增強(qiáng),推測megsin及ERK5在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中起到一定的作用。
　　 2：過表達(dá)megsin糖尿病小鼠腎臟組織中ERK5MAPK、TGF-β和FN表達(dá)明顯增強(qiáng),提示megsin可能與上述因子發(fā)揮了協(xié)同效應(yīng),促進(jìn)DN的發(fā)生與發(fā)展。
　　 3：通過megsin siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,megsin的表達(dá)受抑制后,ERK5MAPK、TGF-β和FN的表達(dá)減少,腎功能受損