益氣養(yǎng)陰消癥通絡中藥對糖尿病腎病的干預及其對氧化應激和p38MAPK信號轉導通路的影響.pdf

1、目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)即糖尿病腎小球硬化癥,是糖尿病最常見、最嚴重的慢性微血管并發(fā)癥之一,也是糖尿病患者致殘與死亡的重要原因。DN的主要病理學特征為:早期腎小球肥大,腎小球基底膜增厚,腎小球系膜區(qū)擴張;晚期細胞外基質(ECM)進行性積聚,導致腎小球硬化、腎小管間質的纖維化。DN的發(fā)病機制可概括為血液動力學和代謝紊亂相互作用的結果,其中貫穿多條信號轉導通路的激活及相關細胞因子的表達,且各種因素相

2、互關聯(lián),形成一個復雜的病理生理學網絡系統(tǒng)。目前DN的防治尚缺乏針對性較強的特效手段,而中醫(yī)中藥以其多靶點的整體調節(jié)和以人為本的個性化治療方案,在臨床防治DN中具有很大的潛力。在臨床實踐中,我們根據中醫(yī)學的病因病機理論,并結合DN的臨床表現(xiàn)、發(fā)病機制及其病理特點,逐步認識到DN的主要病機為氣陰兩虛而致血瘀,血瘀日久不愈而深伏于絡,漸成微小癥積而致本病。本實驗所采用的益氣養(yǎng)陰消癥通絡中藥正是基于以上對DN病因病機的分析而擬定的,用之臨床療效

3、確切,而且前期的臨床和實驗研究證明本方具有保護腎功能及延緩腎小球硬化的作用,本研究試圖以氧化應激和p38MAPK信號轉導通路系統(tǒng)為切入點,旨在從整體和細胞兩個研究水平進一步探索本方對DN發(fā)生發(fā)展的影響及其可能作用機制。
　　 方法:
　　 1益氣養(yǎng)陰消癥通絡中藥對糖尿病大鼠腎臟的保護作用
　　 SD大鼠110只,雄性,SPF級,體重250±20g,適應性飼養(yǎng)一周后,分別測定尿蛋白陰性后行左腎摘除術。2周后大鼠隨機

4、分為單純腎切組和造模組,造模組大鼠腹腔注射STZ(40 mg·kg-1·d-1)一次,72 h后連續(xù)3次測血糖≥16.7 mmol·L-1為糖尿病大鼠。造模組大鼠隨機分為模型組、厄貝沙坦組、中藥低、中、高劑量組。厄貝沙坦組大鼠給予厄貝沙坦15 mg·kg-1·d-1灌胃,中藥低、中、高劑量組大鼠分別給予中藥5.29 g·kg-1·d-1、10.58g.kg-1·d-1、21.16 g·kg-1·d-1灌胃,余組給予等劑量生理鹽水灌胃,每

5、日給藥一次,連續(xù)6周。于給藥第6周末,收集24 h尿液,股動脈采血,處死大鼠,分離皮髓質,檢測各組大鼠24 h尿蛋白定量,光鏡下觀察各組大鼠腎臟的病理改變,及應用RT-PCR方法檢測各組大鼠腎皮質Ⅳ型膠原(α1鏈)的mRNA表達水平。
　　 2益氣養(yǎng)陰消癥通絡中藥對糖尿病大鼠腎臟氧化應激的影響
　　 動物模型的建立、給藥方法同上,于給藥第6周末,留取腎皮質組織標本,應用MDA、SOD檢測試劑盒對各組大鼠腎皮質中MDA含量

6、和SOD活力進行測定。
　　 3益氣養(yǎng)陰消癥通絡中藥對糖尿病大鼠腎臟p38MAPK信號轉導通路的影響
　　 動物模型的建立、給藥方法同上,于給藥第6周末,留取腎皮質組織標本,采用RT-PCR方法檢測各組大鼠腎皮質p38MAPK mRNA表達水平,采用western blot方法檢測各組大鼠腎皮質p38MAPK、p-p38MAPK、STAT3、p-STAT3的蛋白表達水平。
　　 4益氣養(yǎng)陰消癥通絡中藥血清對高糖聯(lián)

7、合AngⅡ培養(yǎng)的大鼠系膜細胞p38MAPK信號轉導通路的影響
　　 4.1大鼠腎小球系膜細胞(MCs)的培養(yǎng)及鑒定
　　 采用原代培養(yǎng)方法進行MCs培養(yǎng),經形態(tài)學、免疫組織化學鑒定培養(yǎng)細胞為MCs,取亞培養(yǎng)的第5～7代細胞用于實驗。
　　 4.2藥物血清制備
　　 SD大鼠12只隨機分為3組,即中藥血清組、厄貝沙坦血清組、正常大鼠血清組,每組4只。中藥血清組和厄貝沙坦血清組大鼠每日以成人劑量/kg的15倍

8、,分2次灌服相應藥物,每次3mL,連續(xù)3天,并于末次給藥1小時后,股動脈無菌取血,分離血清,56℃水浴箱中30分鐘滅活,過濾除菌,-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。正常血清組大鼠每日灌服同等劑量的生理鹽水,采血和分離血清方法同前。
　　 4.3實驗分組及指標檢測
　　 采用MTT法篩選中藥血清濃度后,分組并進行相應藥物干預:低糖對照組(D-葡萄糖濃度5.5mmol·L-1+5％正常大鼠血清)、高糖組(D-葡萄糖濃度25mmol·L-

9、1+5％正常大鼠血清)、高糖+AngⅡ組(D-葡萄糖濃度25mmol·L-1+AngⅡ10-6mol·L-1+5％正常大鼠血清)、厄貝沙坦血清組(D葡萄糖濃度25mmol·L-1+AngⅡ10-6mol·L-1+5％厄貝沙坦血清)、中藥血清組(D-葡萄糖濃度25mmol·L-1+AngⅡ10-6mol·L-1+5％中藥血清),各組均加入含有胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液,使血清終濃度為10％。各組MCs培養(yǎng)48h后,應用ELISA試

10、劑盒測定細胞上清的Col-Ⅳ含量,采用western blot方法檢測各組MCs總蛋白中p38MAPK、p-p38MAPK、STAT3、p-STAT3的蛋白表達水平。
　　 結論:
　　 1.益氣養(yǎng)陰消癥通絡中藥能夠顯著減少糖尿病大鼠尿蛋白的排泄,減輕腎臟病理損害,并能下調Ⅳ型膠原(α1鏈)的基因表達,從而延緩了DN的發(fā)生發(fā)展。
　　 2.益氣養(yǎng)陰消癥通絡中藥能夠抵抗糖尿病大鼠腎臟氧化應激反應,抑制p38MAPK

11、/STAT3信號轉導通路的活化,這可能是其發(fā)揮腎臟保護作用的機制之一。
　　 3.益氣養(yǎng)陰消癥通絡中藥低、中劑量治療效果優(yōu)于高劑量,提示此中藥短期干預DN無濃度依賴性。
　　 4.益氣養(yǎng)陰消癥通絡中藥血清能夠抑制MCs p38 MAPK/STAT3信號轉導通路的激活,下調Col-Ⅳ蛋白表達,最終減少了細胞外基質的積聚,這一結果與本實驗中整體研究結果一致,從而從細胞生物學上對益氣養(yǎng)陰消癥通絡中藥治療DN的可能作用機制予以了