健脾化濕顆粒治療腹瀉型腸易激綜合征的作用及中樞機(jī)制研究.pdf

1、腸易激綜合征(Irritable Bowel Syndrome,IBS)是一種常見的功能性腸病,腹痛、腹脹、大便異常和排便習(xí)慣改變?yōu)橹饕卣?包括腹瀉型、便秘型、混合型和不定型,以腹瀉型較為多見。IBS的全球患病率高,既影響患者的生活質(zhì)量和工作效率,又消耗大量的公共衛(wèi)生資源。該病主要的病理生理學(xué)基礎(chǔ)是腸道動力紊亂和內(nèi)臟高敏感性,其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,可能與腸動力改變、內(nèi)臟感覺過敏、腦-腸軸功能失調(diào)、情志失調(diào)、免疫系統(tǒng)紊亂,內(nèi)分泌功能異

2、常等有關(guān)。近年來,隨著研究的深入,人們越來越認(rèn)識到腦-腸軸在IBS的發(fā)病中起著重要作用。腦腸肽存在于腦-腸軸中,具有激素和神經(jīng)遞質(zhì)雙重功能,在調(diào)節(jié)內(nèi)臟感覺、分泌和運動中起著十分重要的作用。
　　中醫(yī)藥治療IBS有一定的優(yōu)勢和特色,顯示出廣闊的應(yīng)用前景。健脾化濕顆粒(Jianpi Huashi Granule,JPHSG)由炙黃芪、益智仁、炒白術(shù)、茯苓、砂仁等10味藥組成,采用現(xiàn)代工藝制備而成。具有理氣健脾、化濕止瀉等功效。本實驗采

3、用番瀉葉灌胃聯(lián)合束縛應(yīng)激的方法建立腹瀉型腸易激綜合征(Diarrhea-predominant Irritable Bowel Syndrome,D-IBS)大鼠模型,用不同劑量健脾化濕顆粒進(jìn)行干預(yù),觀察其對 D-IBS模型大鼠結(jié)腸運動功能和內(nèi)臟敏感性的影響,從中樞神經(jīng)系統(tǒng)中 c-fos、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(Corticotropin-releasing factor,CRF)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體1(Corticotro

4、pin-releasing factor receptor1,CRF-R1)及5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)的變化來研究其作用機(jī)制,為健脾化濕顆粒治療D-IBS提供理論依據(jù)。
　　第一部分健脾化濕顆粒治療腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠的藥效學(xué)研究
　　目的:
　　觀察JPHSG對D-IBS模型大鼠體重、結(jié)腸運動功能和內(nèi)臟敏感性的影響,評價其治療作用。
　　方法:
　　1動物分組及

5、造模
　　♂SD大鼠72只,隨機(jī)分為正常對照組(NC)、模型對照組(M)、健脾化濕顆粒低劑量組(JPHSG-L)、健脾化濕顆粒中劑量組(JPHSG-M)、健脾化濕顆粒高劑量組(JPHSG-H)和陽性對照組(PC)。除NC組外,其余各組采用番瀉葉水浸液灌胃聯(lián)合束縛應(yīng)激的方法建立D-IBS大鼠模型。
　　2各組用藥及處理
　　成模后,各治療組分別給予相應(yīng)的藥物治療,NC組和M組給予等體積的生理鹽水,給藥14d。
　　

6、3藥效學(xué)觀察
　　分別在建模前、建模7d、建模14d、藥物干預(yù)7d和藥物干預(yù)14d,稱量各組大鼠的體重;采用四導(dǎo)生理記錄儀記錄大鼠結(jié)腸運動曲線,計算結(jié)腸運動指數(shù)及運動指數(shù)變化率;采用直腸擴(kuò)張腹壁撤退反射(AWR)評分為3分時的注水量評價大鼠的內(nèi)臟敏感性。
　　4腸組織病理檢查
　　大鼠處死后,取遠(yuǎn)端結(jié)腸做常規(guī)病理切片HE染色,在顯微鏡下觀察,排除腸粘膜炎性病變。
　　結(jié)果:
　　1 JPHSG對D-IBS模

7、型大鼠體重的影響
　　建模前,各組間無顯著差異(P>0.05);建模后,各建模組大鼠體重增長緩慢,與NC組大鼠相比有顯著差異(P<0.01);藥物干預(yù)后,與M組大鼠相比,JPHSG-H組大鼠體重顯著增加(P<0.05),其他治療組與M組大鼠相比雖有所增加,但無顯著差異(P>0.05)。
　　2 JPHSG對D-IBS模型大鼠結(jié)腸運動功能的影響
　　建模前,各組間無顯著差異(P>0.05);建模后,各建模組大鼠運動指數(shù)和

8、運動指數(shù)變化率均增加,與NC組大鼠相比有顯著差異(P<0.01);藥物干預(yù)后,與M組大鼠相比,JPHSG中、高劑量組大鼠運動指數(shù)和運動指數(shù)變化率均顯著降低(P<0.01),與PC組大鼠相比,JPHSG高劑量組大鼠顯著降低(P<0.05)。
　　3 JPHSG對D-IBS模型大鼠內(nèi)臟敏感性的影響
　　建模前,各組間無顯著差異(P>0.05);建模后,各建模組大鼠 AWR評分為3時的注水量均降低,與NC組大鼠相比有顯著差異(P<

9、0.01);藥物干預(yù)后,與M組大鼠相比,JPHSG中、高劑量組大鼠AWR評分為3時的注水量均顯著增加(P<0.01),與PC組大鼠相比,JPHSG高劑量組大鼠顯著增加(P<0.05)。
　　4腸組織病理檢查
　　病理學(xué)檢查各組大鼠均無水腫、潰瘍、充血、炎癥細(xì)胞浸潤等病理改變,與NC組大鼠相比,其他各組未見明顯差異。
　　結(jié)論:
　　JPHSG對D-IBS模型大鼠有很好的治療作用,可以顯著的改善D-IBS模型大鼠的

10、結(jié)腸運動功能,降低腸道敏感性。
　　第二部分健脾化濕顆粒治療腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠的中樞機(jī)制研究
　　目的:
　　觀察JPHSG對D-IBS模型大鼠中樞c-fos、CRF、CRF-R1和5-HT的影響,探討其作用機(jī)制。
　　方法:
　　1標(biāo)本的采集與處理
　　藥物干預(yù)14d后,麻醉處死大鼠,迅速取出腰膨大段脊髓、前額葉皮質(zhì)、海馬和下丘腦,一部分置于4％的多聚甲醛中固定,用于免疫組化實驗;一部分置于

11、-80℃凍存,用于ELISA和PCR實驗。
　　2采用免疫組化法檢測各組大鼠中樞c-fos、CRF、CRF-R1和5-HT的表達(dá)水平,計算其平均光密度值(mean density),進(jìn)行半定量分析。
　　3采用ELISA法檢測各組大鼠中樞c-fos和5-HT的含量
　　4采用PCR法檢測各組大鼠中樞CRF和CRF-R1 mRNA的表達(dá)水平,計算其相對光密度值(ROD),進(jìn)行半定量分析。
　　結(jié)果:
　　1

12、JPHSG對D-IBS模型大鼠中樞c-fos、CRF、CRF-R1和5-HT表達(dá)水平的影響
　　光鏡下觀察,大鼠中樞 c-fos、CRF、CRF-R1和5-HT的陽性表達(dá)呈棕黃色或深棕色顆粒,NC組大鼠中樞上述指標(biāo)表達(dá)微弱甚至不表達(dá),而M組大鼠中樞可見較多的陽性表達(dá)。
　　1.1 JPHSG對D-IBS模型大鼠中樞c-fos表達(dá)水平的影響
　　與NC組大鼠相比,M組大鼠脊髓背角、前額葉皮質(zhì)、海馬和下丘腦中c-fos的陽

13、性表達(dá)均顯著增加(P<0.01);與M組大鼠相比,JPHSG中、高劑量組大鼠各部位的表達(dá)均顯著降低(P<0.01);JPHSG-L組大鼠前額葉皮質(zhì)和海馬中顯著降低(P<0.05,P<0.01),而脊髓背角和下丘腦中 c-fos表達(dá)無顯著差異(P>0.05);與PC組大鼠相比,JPHSG中、高劑量組大鼠各部位的表達(dá)均顯著降低(P<0.05,P<0.01)。
　　1.2 JPHSG對D-IBS模型大鼠中樞CRF表達(dá)水平的影響
　

14、　與NC組大鼠相比,M組大鼠腦中前額葉皮質(zhì)、海馬和下丘腦中CRF的陽性表達(dá)均顯著增加(P<0.01);與 M組大鼠相比,JPHSG中、高劑量組大鼠各部位的表達(dá)均均顯著降低(P<0.01),JPHSG-L組大鼠海馬中顯著降低(P<0.01),前額葉皮質(zhì)和下丘腦中CRF表達(dá)無顯著差異(P>0.05);與PC組大鼠相比:JPHSG中、高劑量組大鼠各部位的表達(dá)均顯著降低(P<0.05,P<0.01)。
　　1.3 JPHSG對D-IBS模

15、型大鼠中樞CRF-R1表達(dá)水平的影響
　　與 NC組大鼠相比,M組大鼠腦中前額葉皮質(zhì)、海馬和下丘腦中CRF-R1的陽性表達(dá)均顯著增加(P<0.01);與M組大鼠相比,JPHSG中、高劑量組大鼠各部位的表達(dá)均顯著降低(P<0.01),JPHSG-L組 CRF-R1表達(dá)無顯著差異(P>0.05);與PC組大鼠相比,JPHSG中、高劑量組大鼠各部位的表達(dá)均顯著降低(P<0.05,P<0.01)。
　　1.4 JPHSG對D-IBS

16、模型大鼠中樞5-HT表達(dá)水平的影響
　　與NC組大鼠相比,M組大鼠腦中前額葉皮質(zhì)、海馬和下丘腦中5-HT的陽性表達(dá)均顯著增加(P<0.01);與 M組大鼠相比,JPHSG中、高劑量組大鼠各部位的表達(dá)均顯著降低(P<0.01),JPHSG-L組5-HT表達(dá)無顯著差異(P>0.05);與PC組大鼠相比,JPHSG中、高劑量組大鼠的表達(dá)均顯著降低(P<0.05,P<0.01)。
　　2 JPHSG對D-IBS模型大鼠中樞c-fos

17、、5-HT含量的影響
　　2.1 JPHSG對D-IBS模型大鼠中樞c-fos含量的影響
　　與NC組大鼠相比,M組大鼠大鼠脊髓和海馬中c-fos的含量顯著增加(P<0.01);與M組大鼠相比,JPHSG中、高劑量組大鼠脊髓和海馬中的含量顯著降低(P<0.05,P<0.01);與PC組大鼠相比,JPHSG-H組大鼠脊髓和海馬中的含量顯著降低(P<0.05);JPHSG-M組c-fos含量無顯著差異(P>0.05)。
　

18、　2.2 JPHSG對D-IBS模型大鼠腦中5-HT含量的影響
　　與NC組大鼠相比,M組大鼠海馬中的5-HT含量顯著增加(P<0.01);與 M組大鼠相比,JPHSG中、高劑量組大鼠海馬中的含量均顯著降低(P<0.05,P<0.01);與PC組大鼠相比,JPHSG-H海馬中的含量顯著降低(P<0.05),JPHSG-L組5-HT含量無顯著差異(P>0.05)。
　　3 JPHSG對D-IBS模型大鼠中樞CRF和CRF-R1

19、 mRNA表達(dá)水平的影響
　　3.1 JPHSG對D-IBS模型大鼠腦中CRF mRNA表達(dá)水平的影響
　　與NC組大鼠相比,M組大鼠前額葉皮質(zhì)和海馬中CRF mRNA的表達(dá)顯著增加(P<0.01);與M組大鼠相比,各治療組前額葉皮質(zhì)和海馬中的表達(dá)均顯著降低(P<0.05,P<0.01);與PC組大鼠相比,JPHSG中、高劑量組大鼠前額葉皮質(zhì)和海馬中的表達(dá)顯著降低(P<0.05,P<0.01),JPHSG-L組CRF mRN

20、A表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。
　　3.2 JPHSG對D-IBS模型大鼠中樞CRF-R1 mRNA表達(dá)水平的影響
　　與NC組大鼠相比,M組大鼠前額葉皮質(zhì)和海馬中CRF-R1 mRNA的表達(dá)顯著增加(P<0.01);與M組大鼠相比,各治療組前額葉皮質(zhì)和海馬中的表達(dá)顯著降低(P<0.05,P<0.01);與PC組大鼠相比,JPHSG中、高劑量組大鼠前額葉皮質(zhì)和海馬中的表達(dá)顯著降低(P<0.05,P<0.01),JPHSG