hTERT反義基因在舌鱗癌Tca8113細(xì)胞中表達(dá)的研究.pdf

1、大連醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文hTERT反義基因在舌鱗癌Tca8113細(xì)胞中表達(dá)的研究姓名：張麗娟申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：皮膚病及性病學(xué)指導(dǎo)教師：劉曉明2002.5.1空載體pLNCX轉(zhuǎn)染的陽性克隆命名為pLNCXhTERTy作為對(duì)照。提取基因組DNA，用根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX序列設(shè)計(jì)的引物P3、P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)15％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：同時(shí)將提取的基因組DNA用EeoRI和BamHI雙酶切，切下的DNA片段以Neo’基因片段

2、作為探針進(jìn)行雜交，檢測(cè)外源基因的整合。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以DNA測(cè)序法分析端粒酶活性并制作細(xì)胞生長(zhǎng)曲線觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖情況。(結(jié)果：(1)提取Hela細(xì)胞的RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA后，以引玢Pl、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的hTERT基因片段長(zhǎng)度為170bp。(2)構(gòu)建的hTERT基因反義表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)PCR初步篩選鑒定后，進(jìn)一步提取該質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切鑒定，電泳可見162bp的基因片段。酶切結(jié)果正確的質(zhì)粒，再進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明，hTER

3、T基因片段正確地反向插入到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上。(3)PCR和Southern雜交分析外源基因在基因組DNA中的整合：未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞基因組DNA沒有載體的引物序列，因此用P3、P4進(jìn)行PCR無擴(kuò)增帶。pLNCXhTERT。細(xì)胞能擴(kuò)增出不包含hTERT反義基因的載體片段，長(zhǎng)度為176bp。pLNCXhTERT細(xì)胞可擴(kuò)增出含有載體序列及hTERT基因的DNA片段，長(zhǎng)度為332bp。以NeoR基因片段為探針對(duì)酶切的基因組DNA進(jìn)行Southern雜

4、交，轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測(cè)到分子量在1180bp左右的雜交帶，而未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞沒有雜交帶。說明外源hTERT基因已整合到Tca8113細(xì)胞基因組中(4)DNA測(cè)序儀檢測(cè)分析端粒酶活性，可見相差6個(gè)堿基的綠色峰和紅色內(nèi)標(biāo)DNA片段的峰。以每個(gè)峰的峰面積總和作為端粒酶活性的強(qiáng)度結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后Tca8113細(xì)胞的端粒酶活性較轉(zhuǎn)染前明顯降低。(5)繪制生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)速度一，明顯低于對(duì)照細(xì)胞，倍增時(shí)間也明顯延長(zhǎng)。1f結(jié)論：(1)本研究利用體外基