軸突微管損傷對(duì)黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元的影響及機(jī)制研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種以震顫、肌肉僵直、運(yùn)動(dòng)遲緩等一系列癥狀為臨床特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要病變是黑質(zhì)致密部(substantia mgrapars compacta，SNc)多巴胺能神經(jīng)元(dopamine neuron，DA神經(jīng)元)的丟失。隨著人口平均壽命延長(zhǎng)和老齡化出現(xiàn)，PD的發(fā)病率呈現(xiàn)了明顯上升勢(shì)頭，是危害老年人健康的主要疾病之一。因此，探討PD中DA神經(jīng)元變性的機(jī)制以開(kāi)發(fā)出抑制

2、或減緩病變發(fā)展的藥物一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。 近年來(lái)，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，中腦DA神經(jīng)元對(duì)微管解聚劑尤其敏感，提示微管功能異?？赡軈⑴c了帕金森病的發(fā)病過(guò)程。微管系統(tǒng)在DA神經(jīng)元存活中的重要作用，以及黑質(zhì)-紋狀體通路逆行變性的過(guò)程，促使我們觀察DA軸突末梢微管系統(tǒng)對(duì)DA神經(jīng)元存活的影響。我們因此通過(guò)大腦立體定位注射，將微管解聚劑秋水仙堿(colchicine，COL)注射到DA神經(jīng)元軸突的末梢-紋狀體，利用熒光神經(jīng)束路示蹤，免疫熒

3、光和免疫組織化學(xué)，神經(jīng)化學(xué)等方法觀察了在黑質(zhì)和紋狀體所誘發(fā)的一系列病理變化，包括神經(jīng)元損傷和膠質(zhì)細(xì)胞增生；同時(shí)利用動(dòng)物行為學(xué)測(cè)試觀察了與紋狀體黑質(zhì)通路損傷相關(guān)的指標(biāo)。 主要結(jié)果： 1.利用神經(jīng)解剖學(xué)方法和免疫熒光標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，將微管解聚劑COL注射到紋狀體一周后出現(xiàn)SNc部位DA神經(jīng)元的大量死亡。HPLC分析也發(fā)現(xiàn)此時(shí)紋狀體和黑質(zhì)的多巴胺含量大幅度降低。熒光金逆行追蹤實(shí)驗(yàn)提示DA神經(jīng)元的死亡可能與軸突逆行運(yùn)輸障礙有關(guān)；

4、 2.紋狀體神經(jīng)元在COL注射后第三天出現(xiàn)死亡，此時(shí)尚未出現(xiàn)SNc的DA神經(jīng)元死亡。凋亡分析發(fā)現(xiàn)紋狀體凋亡信號(hào)出現(xiàn)在COL注射后第七天；此時(shí)SNc的DA神經(jīng)元未檢測(cè)到凋亡信號(hào)，丘腦的內(nèi)側(cè)膝狀體則有很多神經(jīng)元凋亡，周邊伴隨小膠質(zhì)細(xì)胞活化，提示中樞聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路的損傷； 3.紋狀體和黑質(zhì)的病變誘發(fā)紋狀體和黑質(zhì)網(wǎng)狀部顯著的膠質(zhì)增生：紋狀體內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞在COL注射后不同的時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)出逐漸活化的形態(tài)，至第七天達(dá)到頂點(diǎn)；星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化形

5、態(tài)與其他模型中的活化形態(tài)有顯著差別。黑質(zhì)網(wǎng)狀部也發(fā)現(xiàn)顯著的膠質(zhì)增生。對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行三維重建的圖像提示二者可能存在直接的信息交流； 4.紋狀體內(nèi)注射微管解聚劑造成紋狀體神經(jīng)元和SNc部位DA神經(jīng)元聯(lián)合損傷，對(duì)單側(cè)損傷的小鼠進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試結(jié)果表明：動(dòng)物在多巴胺受體激動(dòng)劑誘發(fā)下會(huì)出現(xiàn)同側(cè)旋轉(zhuǎn)；開(kāi)放區(qū)域測(cè)試發(fā)現(xiàn)其同側(cè)方向偏好。我們進(jìn)一步設(shè)計(jì)了網(wǎng)格方盒以量化其方向偏好，發(fā)現(xiàn)模型小鼠在三天即可出現(xiàn)同側(cè)方向偏好，且這種偏好在后面的時(shí)間點(diǎn)中

6、非常穩(wěn)定。游泳方向測(cè)試同樣發(fā)現(xiàn)其同側(cè)方向偏好，但這種偏好則在幾天后逐漸變化為對(duì)側(cè)方向偏好。 主要結(jié)論： 1.利用在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，軸突微管損傷造成SNc部位DA神經(jīng)元死亡(非凋亡)，可能與逆行軸突運(yùn)輸障礙有關(guān)； 2.紋狀體神經(jīng)元對(duì)微管損傷非常敏感，在微管解聚劑作用下迅速死亡(注射后三天)，但凋亡則出現(xiàn)在注射后一周； 3.體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)COL能直接活化小膠質(zhì)細(xì)胞，提示COL可能通過(guò)直接和間接(損傷的神經(jīng)元)兩

7、種方式活化紋狀體內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞，誘發(fā)由弱到強(qiáng)的逐漸活化；同時(shí)伴隨星形膠質(zhì)細(xì)胞特征性的活化增生； 4.對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)二者之間有密切的相互接觸，從而提出膠質(zhì)突觸(Interglial Synapse，IS)的概念，這對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞功能研究有重要意義； 5.紋狀體和SNc部位神經(jīng)元的聯(lián)合損傷可以作為帕金森型多系統(tǒng)萎縮的動(dòng)物模型，單側(cè)損傷的模式可以利用行為學(xué)指標(biāo)如藥物誘發(fā)動(dòng)物旋轉(zhuǎn)，或自發(fā)方向偏好來(lái)鑒定模型是

8、否成功，這對(duì)探討紋狀體黑質(zhì)變性型多系統(tǒng)萎縮的機(jī)制并尋找神經(jīng)保護(hù)藥物是一個(gè)重要工具； 6.我們所設(shè)計(jì)的網(wǎng)格方盒測(cè)試是研究大腦一側(cè)化的有力而方便的工具。 本研究初步闡明軸突損傷與DA神經(jīng)元死亡的關(guān)系，為進(jìn)一步揭示PD發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，探索PD治療的新靶點(diǎn)提供了重要依據(jù)；同時(shí)，COL誘發(fā)紋狀體黑質(zhì)通路變性可以作為帕金森型多系統(tǒng)萎縮的動(dòng)物疾病模型，這為研究其病理發(fā)生機(jī)制，尋找有效治療策略提供了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?；?duì)膠質(zhì)細(xì)胞活化形態(tài)的觀察使我