內(nèi)皮素-1及內(nèi)皮素A受體拮抗劑對(duì)大鼠腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響.pdf

1、背景與目的：腎間質(zhì)纖維化(Renal Intersititial Fibrosis,RIF)是大多數(shù)腎病進(jìn)展為終末期腎衰竭共同的途徑和主要病理學(xué)基礎(chǔ)。腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,并生成腎間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞(MyoF)是腎間質(zhì)纖維化的重要機(jī)制之一,MyoF可分泌大量的Ⅰ型膠原纖維(collagenⅠ,ColⅠ)、纖連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)(Extra-cellularmatrix ECM)成分,進(jìn)而導(dǎo)致ECM過(guò)度積聚,在腎間質(zhì)纖維化中起到

2、了至關(guān)重要的作用。腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(Epithelial-mesenchymal transition EMT)指腎小管上皮細(xì)胞失去其上皮細(xì)胞表型,獲得間充質(zhì)細(xì)胞特性的過(guò)程,是MyoF的主要來(lái)源,主要相關(guān)蛋白有波形蛋白(Vimelltin)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-Smoothmuscle actin,α-SMA)、E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、緊密連接蛋白(zonulaoccludens-1,ZO-1)及ColⅠ等,α-S

3、MA是具有收縮功能的細(xì)胞骨架微絲結(jié)構(gòu),在轉(zhuǎn)分化過(guò)程中表達(dá)增多,是腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化形成MyoF的標(biāo)志蛋白,不但標(biāo)志上皮細(xì)胞產(chǎn)生形態(tài)學(xué)變化,而且也使MyoF具備遷移、浸潤(rùn)和收縮功能。Vimentin表達(dá)于間充質(zhì)細(xì)胞,是一種參與形成細(xì)胞骨架的中間絲蛋白,在轉(zhuǎn)分化過(guò)程中表達(dá)亦增多。E-cadherin是一種腎小管上皮細(xì)胞間的粘附分子,是反映上皮細(xì)胞特征的重要標(biāo)志,在轉(zhuǎn)分化過(guò)程中表達(dá)被抑制。EMT在發(fā)生的早期撤除損傷刺激,EMT具有一定的可逆

4、性,當(dāng)損傷刺激持續(xù)一定時(shí)間后,EMT才變得不可逆,所以,損傷刺激的作用時(shí)間是EMT發(fā)生的一個(gè)重要因素。
　　 內(nèi)皮素-1(Endothelin-1,ET-1)是目前已知內(nèi)源性的最強(qiáng)和效應(yīng)最持久的內(nèi)源性血管收縮劑。在腎臟中,血管內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞、系膜細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞均可分泌ET-1,并通過(guò)與2種不同內(nèi)皮素受體(ETA受體和ETB受體)結(jié)合,影響細(xì)胞微環(huán)境,發(fā)揮不同的生理作用。生理狀態(tài)下ET-1參與調(diào)節(jié)腎小球過(guò)濾率、腎臟血流量、

5、腎小管重吸收及腎細(xì)胞生物學(xué)功能等多種重要功能的調(diào)節(jié)。多種因素如:醛固酮、血管緊張素Ⅱ、缺氧、活性氧等均可促進(jìn)ET-1的產(chǎn)生。大量的研究顯示,在不同原因引起的CKD中,ET-1可通過(guò)與ETA受體結(jié)合,介導(dǎo)RIF,細(xì)胞增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。ET-1介導(dǎo)腎臟損傷的途徑除了其具有強(qiáng)大的腎臟血管的收縮作用、促進(jìn)系膜細(xì)胞收縮及趨化單核細(xì)胞外,還參與促進(jìn)了RIF。目前的研究表明ET-1參與RIF的途徑可能有:(1)與RAS系統(tǒng)的相互作用,促進(jìn)醛固酮增多

6、;(2)促進(jìn)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖:(3)調(diào)節(jié)MMPs/TIMPs,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)積聚。而在人體其他組織中如:卵巢癌的發(fā)生、肺纖維化過(guò)程,ET-1還具有介導(dǎo)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的功能。最近發(fā)現(xiàn)在糖尿病大鼠模型中,可檢測(cè)到腎小管上皮細(xì)胞中,內(nèi)皮素-1與α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)增多,E-鈣粘蛋白的表達(dá)降低,且冬蟲(chóng)夏草可抑制上述過(guò)程,提示ET-1可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,參與RIF過(guò)程。目前,關(guān)于內(nèi)皮素受體拮抗劑的研究已廣泛開(kāi)展,內(nèi)皮素受體拮抗劑中

7、目前研究的最多的是選擇性A受體拮抗劑和非選擇性受體拮抗劑,現(xiàn)有的研究資料表明,這2種拮抗劑中,選擇性A受體拮抗劑具有更好的抗高血壓和降尿蛋白的作用,并且比非選擇性受體拮抗劑的副作用更少。本實(shí)驗(yàn)中BQ123時(shí)即屬于內(nèi)皮素A受體拮抗劑。
　　 ET-1作為重要的促纖維化因子,EMT作為RIF的重要途徑之一,二者之間的關(guān)系尚未完全明確。為進(jìn)一步明確ET-1與EMT之間的關(guān)系,本文通過(guò)觀察內(nèi)皮素-1(ET-1)及內(nèi)皮素A受體拮抗劑(ET

8、aRA)對(duì)大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK53E)轉(zhuǎn)分化(EMT)的影響,探討ET-1參與腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。
　　 方法:應(yīng)用ET-1刺激體外培養(yǎng)的NRK52E或經(jīng)ETaRA預(yù)處的NRK-52E細(xì)胞,應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)分化相關(guān)蛋白α-SMA、vimentin及E-cadherin mRNA的表達(dá);應(yīng)用western印跡檢測(cè)α-SMA、vimentin及E-cadherin蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.

9、ET-1(10-11-10-7mol/L,60h)可以上調(diào)NRK52細(xì)胞α-SMA、vimentin及下調(diào)E-cadherin的表達(dá),10-7mol/L作用最明顯,呈濃度依賴(P＜0.05)。
　　 2.應(yīng)用10-7mol/L ET-1刺激NRK52E時(shí),α-SMA、vimentin在36h時(shí)開(kāi)始增多,于60h時(shí)達(dá)到高峰;E-cadherin在36h時(shí)開(kāi)始減少,于60h時(shí)達(dá)到最低。Α-SMA、vimentin mRNA于36h時(shí)

10、開(kāi)始升高,60h時(shí)達(dá)到高峰;E-cadherin mRNA于36h時(shí)開(kāi)始減少,60h時(shí)達(dá)到最低(P＜0.05)。
　　 3.ETaRA可特異性阻斷上述作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.ET-1可上調(diào)α-SMA、vimentin及下調(diào)E-cadherin的表達(dá),刺激NRK52E轉(zhuǎn)分化,并可能經(jīng)由此途徑參與疾病狀態(tài)下的腎間質(zhì)纖維化過(guò)程。
　　 2.ET-1刺激NRK52E轉(zhuǎn)分化部分由內(nèi)皮素A受體介導(dǎo)。