內(nèi)皮素受體拮抗劑對(duì)肝硬化大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)的影響.pdf

1、目的:
　　 肝硬變(Liver cirrhosis)是指肝臟纖維結(jié)締組織彌漫性增生伴有肝細(xì)胞結(jié)節(jié)狀再生。正常肝小葉結(jié)構(gòu)的減少、消失是所有形式肝硬變的最重要特點(diǎn)。同時(shí)可見顯著的肝實(shí)質(zhì)壞死，彌慢的纖維結(jié)締組織沉積，不同程度的再生增殖結(jié)節(jié)，正常肝小葉減少、結(jié)構(gòu)紊亂（片狀壞死、連接匯管區(qū)門靜脈與中央靜脈的橋狀壞死），血流動(dòng)力學(xué)改變（緣于肝實(shí)質(zhì)壞死、肝內(nèi)門體分流、纖維間隔的形成）。肝硬變的具體機(jī)制包括：肝小葉內(nèi)，匯管區(qū)門靜脈周圍的纖維增

2、殖；肝細(xì)胞損害引起的纖維化；肝小葉及橋狀壞死引起的網(wǎng)狀纖維支架塌陷（膠原纖維并沒有增加）；新生纖維增多，降解減少；由肝內(nèi)小膽管增殖引起的纖維化。肝纖維化時(shí)，膠原纖維先構(gòu)建骨架結(jié)構(gòu)，以供其它細(xì)胞外基質(zhì)著床。細(xì)胞外基質(zhì)大量增殖，沉積在狄氏間隙及肝竇間質(zhì)細(xì)胞和肝中央靜脈周圍，在肝竇內(nèi)皮下形成一層基底膜，妨礙肝竇血流與肝細(xì)胞間物質(zhì)交換。最終，肝小葉結(jié)構(gòu)改變，肝內(nèi)小血管狹窄及阻塞，門靜脈壓力增高。肝星狀細(xì)胞在肝硬化門靜脈高壓的發(fā)生發(fā)展中具有重要作

3、用?；罨母涡菭罴?xì)胞的細(xì)胞遷移和粘附以及炎性細(xì)胞趨化反應(yīng)增強(qiáng)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞，分泌大量以Ⅰ型膠原為代表的細(xì)胞外基質(zhì)，在肝臟纖維化增殖，尤其是肝小葉內(nèi)纖維化方面發(fā)揮重要作用。在分子水平，此過程受到多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1由于具有強(qiáng)大的成纖維作用而受到關(guān)注，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1可通過多種信號(hào)途經(jīng)活化肝星狀細(xì)胞，激活Ⅰ型膠原啟動(dòng)子，增加Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)。
　　 內(nèi)皮素是1988

4、年日本學(xué)者在豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離出的一種強(qiáng)烈血管活性肽，參與血管張力的維持及全身血流動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)，其在心血管疾病治療中的作用已得到廣泛認(rèn)可。它是一組由21個(gè)氨基酸組成的小分子活性肽家族，主要包括3種異構(gòu)體，內(nèi)皮素-1、內(nèi)皮素-2、內(nèi)皮素-3，其中內(nèi)皮素-1的血管作用最強(qiáng)。同時(shí)，內(nèi)皮素還具有強(qiáng)烈的促生長(zhǎng)和致纖維化作用。內(nèi)皮素的作用主要由2種亞型的受體介導(dǎo)，即內(nèi)皮素A和內(nèi)皮素B受體。在肝臟，內(nèi)皮素A受體主要分布于肝星狀細(xì)胞，而內(nèi)皮

5、素B受體均勻分布于肝星狀細(xì)胞和竇內(nèi)皮細(xì)胞。在肝硬變患者，血漿內(nèi)皮素濃度明顯增高，而且內(nèi)皮素升高的程度與肝硬變的嚴(yán)重度，是否有腹水，是否有肝腎綜合征均有關(guān)。肝硬化患者血漿內(nèi)皮素濃度增高，其受體mRNA表達(dá)平行升高，肝星狀細(xì)胞活化，內(nèi)皮素引起活化的肝星狀細(xì)胞收縮性增強(qiáng)，導(dǎo)致肝內(nèi)血管阻力和門靜脈壓力的增加，可能是門靜脈高壓形成的重要病理機(jī)制之一；另一方面，內(nèi)皮素促使肝星狀細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，分泌以Ⅰ型膠原為代表的細(xì)胞外基質(zhì)，從而在肝硬化的發(fā)

6、展中發(fā)揮重要作用。因此，對(duì)內(nèi)皮素誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞收縮性進(jìn)行抑制有可能成為治療肝硬化門靜脈高壓癥的新途徑。隨著對(duì)內(nèi)皮索在肝硬化門脈高壓發(fā)生和發(fā)展中重要作用認(rèn)識(shí)的深入，抑制內(nèi)皮素作用的方法也迅速發(fā)展。目前主要有，內(nèi)皮素受體拮抗劑和內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶抑制劑。由于大部分內(nèi)皮素-1可由非內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶介導(dǎo)轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮素-1，所以影響了ECE抑制劑的有效性，限制了其使用。目前研究較多的是內(nèi)皮素受體拮抗劑，本實(shí)驗(yàn)旨在觀察四氯化碳誘導(dǎo)的肝硬化大鼠肝組織TGFβ1

7、和Ⅰ型膠原(CollagenDmRNA表達(dá)的變化，以及內(nèi)皮素受體拮抗劑對(duì)其表達(dá)的影響。探討內(nèi)皮素與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1在肝硬化門脈高壓形成中的作用及其機(jī)制。
　　 材料與方法:
　　 1主要試劑四氯化碳，分析純，分子量153.82，北京化工廠。藥品BQ-123,BQ-788購(gòu)自CALBIOCHEM公司。RT-PCR相關(guān)試劑均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。
　　 2動(dòng)物模型制備及實(shí)驗(yàn)分組40只清潔級(jí)雄性Sprague

8、-Dawley大鼠購(gòu)自鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體重370-400g。采用隨機(jī)數(shù)字法分為正常對(duì)照組：(NL，n=8)，普通飼養(yǎng)，不做任何處理；其余32只制備肝硬化模型（質(zhì)量分?jǐn)?shù)50％的四氯化碳，按3ml/kg體重灌胃，間隔6d/次，共10次）。模型組32只大鼠進(jìn)一步分為：模型對(duì)照組(CCl4，n=8)、內(nèi)皮素A受體拮抗劑組(ETRAa，n=8)、內(nèi)皮素B受體拮抗劑組(ETRBa，n=8)，聯(lián)合治療組(ETRA+B，n=8)，后3組內(nèi)皮素受體

9、拮抗劑處理每天2次（間隔10h），分別皮下注射內(nèi)皮素受體拮抗劑BQ-123(12.5μg/Kg,10nmol/min)和BQ-788(15μg/Kg,10nmol/min)，以及BQ-123+BQ788(12.5μg/kg±15μg/kg，10nmol/min)。依據(jù)前期的試驗(yàn)，上述BQ-123及BQ-788的應(yīng)用劑量可使血藥峰值濃度達(dá)到10-7mol/L，此濃度將能夠產(chǎn)生最大的阻斷作用。最后一次CCl4灌胃3d后，禁食12h，1％戊巴

10、比妥鈉50mg/Kg腹腔注射麻醉。取部分肝組織經(jīng)10％甲醛固定后行常規(guī)病理學(xué)檢測(cè)，剩余肝組織置液氮保存，準(zhǔn)備提取總RNA。
　　 3肝組織Collagen ImRNA和TGFβ1mRNA測(cè)定
　　 ①肝組織總RNA的提?。翰捎肨RIZOL試劑提取肝組織總RNA。分光光度計(jì)測(cè)定提取的總RNA含量及純度，要求OD260/OD280值在1.8-2.0之間。
　　 ②逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)：取肝組織總RNA4

11、μg，ThermoScriptTMRT總反應(yīng)體系20μl，于65℃反應(yīng)1h.
　　 ④多聚酶鏈反應(yīng)：取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA1μl，總體積25μl，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，30個(gè)循環(huán)，72℃后延伸7min。
　　 ⑤擴(kuò)增產(chǎn)物的定量分析：RT-PCR結(jié)果可見443bp和298bp的DNA擴(kuò)增特異條帶，分別為大鼠肝組織Collagen I-cDNA和T

12、GFβ1-cDNA片段，以Kodak120凝膠成像系統(tǒng)對(duì)DNA擴(kuò)增帶進(jìn)行圖像分析，以Collagen I/GAPDH和TGFβ1/β-actin的比值表示Collagen I mRNA和TGFβ1mRNA的相對(duì)表達(dá)量。
　　 4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，多組間均數(shù)比較采用隨機(jī)單位組設(shè)計(jì)資料的方差分析，p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:<

13、br>　　 ①病理結(jié)果：正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞未見變性及壞死等病變，個(gè)別匯管區(qū)散在少數(shù)淋巴樣細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)。CCl4肝硬化模型組炎癥反應(yīng)最重，肝組織正常小葉結(jié)構(gòu)消失，肝實(shí)質(zhì)被纖維隔包繞，分割成大小不等的假小葉，可見較大范圍彌漫的肝損害。內(nèi)皮素受體拮抗劑應(yīng)用組較模型對(duì)照組肝臟炎癥反應(yīng)及纖維化明顯減輕，可見散在分布的纖維隔以及匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 ②內(nèi)皮素受體拮抗劑對(duì)肝硬化大鼠肝組織TGFβ1mRNA表達(dá)的影響

14、：肝組織TGFβ1mRNA表達(dá)的研究表明：模型對(duì)照組肝組織TGFβ1mRNA表達(dá)升高142％，顯著高于正常對(duì)照組（0.75±0.15vs.0.31±0.05，P＜0.05）；內(nèi)皮素A受體拮抗劑組、內(nèi)皮素B受體拮抗劑組和聯(lián)合治療組，其肝組織TGFβ1mRNA表達(dá)水平均低于模型對(duì)照組，其中聯(lián)合治療組TGFβ1mRNA表達(dá)水平最低，降低約28％但尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（P＞0.05）。
　　 ③內(nèi)皮素受體拮抗劑對(duì)肝硬化大鼠肝組織I型膠原

15、mRNA表達(dá)的影響：肝組織Collagen I mRNA表達(dá)的研究表明：模型對(duì)照組肝組織Collagen I mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組顯著升高（0.87±0.17vs.0.43±0.08，P＜0.05）；應(yīng)用內(nèi)皮素受體拮抗劑后，無(wú)論是內(nèi)皮素A受體拮抗劑組、內(nèi)皮素B受體拮抗劑組或聯(lián)合治療組，其肝組織Collagen I mRNA表達(dá)水平均低于模型對(duì)照組，P＜0.05。且聯(lián)合治療組組CollagenⅠmRNA表達(dá)水平最低，降低達(dá)37％。