中性粒細(xì)胞對結(jié)核分枝桿菌吞噬和殺傷活性的探討.pdf

1、研究背景：嗜中性粒細(xì)胞或多形核細(xì)胞（polymorphonuclear cells, PMN）是機(jī)體天然免疫的主要免疫細(xì)胞。在炎癥反應(yīng)中,中性粒細(xì)胞（PMN）是最先到達(dá)感染部位的細(xì)胞，對炎癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸起到了關(guān)鍵作用。結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, M.tb)感染引起的，目前仍是發(fā)病率和病死率最高的傳染病之一。一般認(rèn)為巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞在抗結(jié)核感染免疫中起重要作用，而PMN在結(jié)核感染

2、中的作用卻一直很少被注意到。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PMN這一具有天然免疫作用的細(xì)胞可能也參與抗結(jié)核感染的免疫保護(hù)作用，但PMN在抗結(jié)核感染的免疫保護(hù)作用中的確切機(jī)制尚未明確。探討PMN在抗結(jié)核感染的天然免疫作用的具體作用機(jī)理，對全面了解結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制和機(jī)體抗結(jié)核感染的免疫保護(hù)機(jī)制，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　目的：建立用流式細(xì)胞術(shù)檢測人外周血PMN吞噬M.tb的方法；觀察Th1型細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ、Th1型細(xì)胞誘

3、導(dǎo)因子IL-12，Th2型細(xì)胞因子IL-4以及共同細(xì)胞因子GM-CSF對人外周血PMN吞噬M.tb活性的影響；觀察人外周血PMN吞噬M.tb后呼吸爆發(fā)活性氧（ROS）產(chǎn)生；建立流式細(xì)胞術(shù)檢測人外周血 PMN殺傷M.tb的實(shí)驗(yàn)方法。
　　方法：
　　1.用不同濃度異硫氰酸熒光素（FITC）在磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.2）和碳酸鹽緩沖液（CB，pH9.5）中標(biāo)記M.tb，流式細(xì)胞術(shù)檢測標(biāo)記率和熒光強(qiáng)度（MFI）。2.取新鮮健

4、康成人外周血與標(biāo)記M.tb于37℃孵育5～20 min后，洗滌和溶血，用流式細(xì)胞術(shù)檢測PMN吞噬百分率。
　　3.取新鮮健康成人外周血與M.tb于37℃孵育20 min后，洗滌和溶血，抗酸染色，顯微鏡觀察PMN吞噬M.tb。
　　4.取健康成人外周血與FITC標(biāo)記的M.tb和抗人CD16-PE，置37℃水浴孵育20 min，溶血和洗滌，激光共聚焦顯微鏡觀察PMN吞噬M.tb。
　　5.外周血預(yù)先分別與不同濃度的Th1型

5、細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ，以及Th1型細(xì)胞誘導(dǎo)因子IL-12孵育2 h,再加標(biāo)記M.tb孵育5 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測PMN吞噬率，并與對照組比較計(jì)算吞噬增加比率。
　　6.外周血預(yù)先分別與不同濃度的Th2型細(xì)胞因子 IL-4和共同細(xì)胞因子 GM-CSF孵育2 h,再加標(biāo)記M.tb分別孵育5 min和15 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測PMN吞噬率，并與對照組比較計(jì)算吞噬變化比率。
　　7.取健康成人外周血與M.tb和2′7′二

6、氯二氫熒光素二酯酸（DCFH-DA）混勻，置37℃水浴0～30 min，洗滌和溶血，流式細(xì)胞術(shù)檢測產(chǎn)生ROS的PMN為活化PMN，計(jì)算活化PMN的比率，以及檢測活化PMN的平均熒光強(qiáng)度計(jì)算ROS產(chǎn)生量。
　　8.用熒光素二醋酸酯（FDA）標(biāo)記M.tb，流式細(xì)胞術(shù)檢測FDA標(biāo)記率；取健康成人外周血與FDA標(biāo)記的M.tb于37℃孵育20 min，洗滌溶血，加入自體血清，置37℃孵育0～60 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測標(biāo)記M.tb的FDA的

7、熒光強(qiáng)度減少計(jì)算PMN對M.tb的殺傷率。
　　結(jié)果:
　　1. M.tb用不同濃度FITC（10~40μg/ml）在PBS中標(biāo)記的標(biāo)記率從由85％增加到93%有顯著性差異（p<0.01），MFI從326增加到517，也有顯著性差異（p<0.01）；但M.tb用不同濃度FITC在CB中標(biāo)記，標(biāo)記率和MFI均無顯著性差異。
　　2.人PMN與FITC標(biāo)記M.tb在37℃水浴作用不同時(shí)間后，PMN的吞噬率隨時(shí)間增加而增加（

8、p<0.05），15 min吞噬率達(dá)到65％左右；15～20 min達(dá)到吞噬平臺期。3.人PMN吞噬M.tb20 min，抗酸染色觀察PMN內(nèi)有大量的紅色索狀M.tb。
　　4.人PMN用抗人CD16-PE染色，吞噬FITC標(biāo)記M.tb20 min，用激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)著紅色的PMN內(nèi)有發(fā)綠色熒光的M.tb存在。
　　5.用不同濃度IL-2（5~160 U/ml）預(yù)處理人PMN2h后，發(fā)現(xiàn)PMN5 min吞噬百分率與

9、對照組比較在40 U/ml時(shí)開始增加，且隨濃度增加吞噬率增高（p<0.05），160 U/ml吞噬率較對照組增加77%。不同濃度IFN-γ（50~800U/ml）預(yù)處理人PMN2 h，吞噬率隨濃度增加而增高（p<0.01），100 U/ml時(shí)吞噬增加率即可達(dá)到60%。不同濃度IL-12（10~240 U/ml）預(yù)處理人PMN2 h，發(fā)現(xiàn)吞噬率隨濃度增加而增高（p<0.01），240 U/ml時(shí)吞噬增加率最高可達(dá)到79%。
　　6.

10、不同濃度IL-4（10~200U/ml）預(yù)處理人PMN2 h后，發(fā)現(xiàn)PMN5 min吞噬百分率與對照組比較在200 U/ml時(shí)降低了31%，15 min吞噬百分率在50 U/ml時(shí)降低14%，隨濃度增加吞噬率降低（p<0.05），200 U/ml吞噬降低率達(dá)32%。不同濃度GM-CSF（10~200 U/ml）預(yù)處理人PMN2h后， PMN吞噬M.tb5 min和15 min吞噬百分率和對照組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。<

11、br>　　7.人PMN與M.tb在37℃水浴作用不同時(shí)間后，產(chǎn)生ROS的活化PMN隨時(shí)間增加而增加（p<0.05），15 min活化率達(dá)到72％左右，15～30 min達(dá)到平臺期，同時(shí)活化PMN產(chǎn)生的ROS量也隨時(shí)間增加而增加（p<0.05）。
　　8.人PMN吞噬FDA標(biāo)記M.tb20min后，流式細(xì)胞術(shù)檢測PMN對M.tb0～60 min殺傷率，結(jié)果顯示，PMN在吞噬M.tb20min后對M.tb30min和60min的殺傷率

12、分別為16%和26%，殺傷率隨時(shí)間增加而增加。
　　結(jié)論：
　　1. FITC濃度對M.tb標(biāo)記率和MFI均有影響。
　　2.用流式細(xì)胞術(shù)可檢測到人PMN對M.tb的吞噬活性，吞噬率隨共孵育時(shí)間延長而增加，15～20 min達(dá)到吞噬平臺期。
　　3. Th1型細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ和IL-12上調(diào)PMN吞噬M.tb功能，Th2型細(xì)胞因子IL-4下調(diào)PMN吞噬M.tb功能，表明這兩型細(xì)胞因子在結(jié)核免疫中具有調(diào)