devR基因突變對結(jié)核分枝桿菌細胞毒性的影響.pdf

1、結(jié)核病的病死率僅次于HIV的感染，已經(jīng)嚴重威脅到了全人類的生存和健康。我國作為結(jié)核病負擔大國，結(jié)核分枝桿菌的耐藥問題也日漸突出，因此研究結(jié)核分枝桿菌的耐藥和基因突變機制，對于疾病的防控意義重大。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌雙組份系統(tǒng)的 devR(反應(yīng)調(diào)節(jié)子編碼基因)在臨床耐藥菌株中出現(xiàn)不同程度的升高表達現(xiàn)象，并利用同源重組方法構(gòu)建了devR基因敲除的卡介苗菌株。本課題在前期工作基礎(chǔ)上，構(gòu)建了乙酰胺啟動子誘導表達devR的回補菌株，并通

2、過驗證devR對巨噬細胞和上皮細胞的毒性作用，進一步探索了devR缺失導致的休眠障礙與結(jié)核分枝桿菌細胞毒性的關(guān)系。
　　一、devR基因回補菌株構(gòu)建及鑒定
　　1.構(gòu)建由乙酰胺啟動子誘導表達devR的重組BCG菌株
　　利用PJV53質(zhì)粒和Pcherry3質(zhì)粒及目的基因，構(gòu)建乙酰胺啟動子啟動表達devR的重組載體，電轉(zhuǎn)化入devR敲除的BCG菌株感受態(tài)中，經(jīng)PCR、雙酶切和測序鑒定正確后，命名此重組菌株為devR回補菌

3、株(Pcherry3-Acetamindase-devR)。
　　2.重組BCG菌株P(guān)cherry3-Acetamindase-devR生長特性的觀察
　　將 BCG野生菌株、devR敲除菌株和devR回補菌株分別培養(yǎng)至對數(shù)生長期即 OD600=0.6時，調(diào)整菌量至105 CFU/mL，以菌液和培養(yǎng)基比例為1:50接種至含有各自抗生素抗性的7H9液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別在第1-14 d測定OD600值，繪制細菌生長曲線。結(jié)果顯

4、示，devR敲除菌株在早期(2～10 d)生長較BCG野生菌株明顯加快(P<0.01)；devR回補菌株和BCG野生菌株之間的生長無顯著性差異(P>0.05)。
　　3.三種菌株對異煙肼和利福平的耐藥發(fā)生率檢測
　　將BCG野生菌株、devR敲除菌株和devR回補菌株以1個McFarland濃度接種到分別含有10倍MIC濃度的異煙肼和利福平的7H10固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)28天，計數(shù)培養(yǎng)基上生長出的菌落數(shù)，得到耐藥發(fā)生率。結(jié)果顯示

5、，三種菌株對異煙肼和利福平的耐藥發(fā)生率均無顯著性差異(P>0.05)。
　　二、三種菌株分別感染上皮細胞A549和巨噬細胞Raw264.7的細胞毒性檢測
　　三種菌株均以感染復數(shù)(MOI)等于10∶1分別感染上皮細胞 A549巨噬細胞Raw264.7，分別采用流式細胞儀和酶聯(lián)免疫吸附試驗于0、24、48、72 h測定細胞凋亡率和乳酸脫氫酶(LDH)釋放水平；采用RT-PCR方法測定凋亡相關(guān)基因bcl-2和bad的表達。

6、>　　細胞感染試驗結(jié)果顯示，devR敲除菌株感染A549細胞和Raw264.7細胞后，細胞的凋亡和壞死效應(yīng)明顯增加，相較于 BCG野生菌株和devR回補菌株差異顯著(P<0.05)；三種菌株感染A549細胞均導致凋亡相關(guān)基因bcl-2表達升高，并且devR敲除菌株感染組明顯高于 BCG和devR回補菌株感染組(P<0.05)；三種菌株感染Raw264.7細胞均導致凋亡相關(guān)基因bad表達升高，并且devR敲除菌株感染組明顯高于BCG野生菌