真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-MDC-IFN-γ-VP1的構(gòu)建及免疫效果研究.pdf

1、目的：柯薩奇病毒B組3型(Coxsackievirus group B type3， CVB3)是引起人類病毒性心肌炎的主要病原體。VP1是CVB3的主要衣殼蛋白，含有幾個(gè)T細(xì)胞和B細(xì)胞表位，免疫原性強(qiáng)，可刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體。但國(guó)內(nèi)外研究表明，編碼VP1的DNA疫苗免疫小鼠后雖然可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，但效價(jià)比較低，不能有效阻止致死量CVB3的感染。因此，如何增強(qiáng)VP1基因的免疫原性，提高免疫保護(hù)作用是當(dāng)前倍受關(guān)注的問(wèn)題，也是

2、本室近幾年的研究重點(diǎn)。
　　 本室曾采用DNA疫苗的靶向策略[51，將巨噬細(xì)胞源趨化因子(MDC)與VP1基因融合，構(gòu)建成融合DNA疫苗pcDNA3/MDC-VP1，對(duì)致死量的CVB3攻擊的保護(hù)率有一定程度的提高，但仍達(dá)不到實(shí)用程度。本室曾嘗試?yán)肐L-2、IL-18、GM-CSF等細(xì)胞因子作為基因佐劑，來(lái)提高pcDNA3/MDC-VP1融合DNA疫苗的免疫原性，都有一定的效果，但仍不能有效阻止致死量病毒感染。
　　 I

3、FN-γ是一種能對(duì)多種細(xì)胞產(chǎn)生上調(diào)和誘導(dǎo)MHC-Ⅰ、Ⅱ類分子作用的細(xì)胞因子。MDC對(duì)抗原提呈細(xì)胞(APC)的趨化作用，更好的發(fā)揮干擾素的免疫增強(qiáng)作用，同時(shí)介導(dǎo)VP1進(jìn)入APC細(xì)胞，從而促進(jìn)抗原加工遞呈。另外MDC對(duì)Th2細(xì)胞具有趨化作用，這將增加APC和Th2細(xì)胞的結(jié)合機(jī)率，從而增強(qiáng)VP1引起的免疫效應(yīng)。本研究聯(lián)合應(yīng)用MDC和IFN-γ，構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1，通過(guò)免疫小鼠后誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答水平和

4、病毒攻擊后免疫保護(hù)作用來(lái)觀察接種后的免疫效果。
　　 方法：(1)利用本室前期構(gòu)建的pcDNA3/IFN-γ質(zhì)粒，用自行設(shè)計(jì)的IFN-γ特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2)將擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，構(gòu)建質(zhì)粒pMD18-T/ IFN-γ，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，篩選重組子，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序；(3)取酶切的IFN-γ片段與經(jīng)過(guò)同樣酶切的pcDNA3[MDC-VP1載體連接，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化、篩選和酶切鑒定后，構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)

5、粒pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1，并進(jìn)行測(cè)序；(4)用堿裂解法從轉(zhuǎn)化的DH5α大腸桿菌中大量提取質(zhì)粒pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1、pcDNA3/MDC-VP1、pcDNA3/VP1和pcDNA3/IFN-γ，用聚乙二醇(PEG)沉淀法進(jìn)行純化；(5)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：將6～8周齡雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組，每組23只；分別為生理鹽水對(duì)照組、pcDNA3/VP1對(duì)照組、pcDNA3/IFN-γ對(duì)照組、pcDNA3/MD

6、C-VP1對(duì)照組、pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1組。純化后的質(zhì)粒以生理鹽水稀釋后，股四頭肌注射免疫小鼠，每次每只接種100ug，每3周免疫一次，共免疫3次；每次免疫后第20天，眼眶靜脈采血，分離血清，用微量中和試驗(yàn)（固定病毒-稀釋血清法）檢測(cè)血清中CVB3特異性中和抗體。第三次免疫后3周，每組3只小鼠取脾臟制備淋巴細(xì)胞懸液，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8， CCK-8)法進(jìn)行特異性淋巴細(xì)胞增殖活性和

7、特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte， CTL)殺傷活性的檢測(cè)；另每組20只小鼠用5LD50CVB3進(jìn)行腹腔注射，觀察并記錄小鼠存活情況至感染后第21天。
　　 結(jié)果：(1)用自行設(shè)計(jì)的IFN-γ特異性引物經(jīng)PCR擴(kuò)增出了IFN-γ基因片段，基因片段的長(zhǎng)度與預(yù)期結(jié)果符合。(2)成功構(gòu)建原核克隆載體pMD18-T/IFN-γ，DNA測(cè)序證實(shí)目的基因序列與Genbank登錄序列相同。(3)基因序列插

8、入pcDNA3/MDC-VP1后，酶切和測(cè)序結(jié)果證實(shí)成功構(gòu)建了pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1。(4)各次免疫后血清CVB3VP1特異性IgG水平分別為：pcDNA3/MDC-VP1組1:7.07，1:16.82，1:28.28；pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1組1：7.32，1：18.02，1:29.28;其余組各次平均效價(jià)均低于1:5。單因素方差分析表明，三次免疫后以上兩組中和抗體滴度逐次增加，但兩組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

9、。其他各組間無(wú)差異。(5)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性經(jīng)單因素方差分析表明，以CVB3刺激時(shí)，pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1組高于pcDNA3/MDC-VP1組(P＜0.05);以ConA刺激時(shí)，兩組無(wú)差異。(6)小鼠脾淋巴細(xì)胞特異性CTL殺傷活性經(jīng)單因素方差分析表明，pcDNA3/IFN-組、pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1組均高于pcDNA3/MDC-VP1組(P＜0.05)。(7)用5LD50CVB3攻擊小鼠，各組平均

10、存活率分別為：生理鹽水對(duì)照組10％，pcDNA3/IFN-γ組20％，pcDNA3/VP1組15％,+pcDNA3/MDC-VP1組40％,pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1組35％。
　　 結(jié)論：(1)成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pMD18-T/IFN-γ。(2)成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1。(3)用致死量CVB3攻擊小鼠后，各組均未能有效的增強(qiáng)小鼠的免疫保護(hù)作用，不能預(yù)防致死量CVB3感染。