CVB3 VP1基因真核質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)及對細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：
　　 構(gòu)建柯薩奇病毒(CVB3)結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因的真核質(zhì)粒pBudCE4.1-VP1，并檢測其在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)，研究VP1蛋白對HeLa細(xì)胞形態(tài)、活性及細(xì)胞周期等方面的影響，為探討CVB3的分子致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.質(zhì)粒pBudCE4.1-VP1構(gòu)建：抽提CVB3感染的HeLa細(xì)胞的總mRNA，RT-PCR擴(kuò)增VP1基因，經(jīng)KpnⅠ和BgⅢ雙酶切后，克隆于真核載體pBudCE

2、4.1中，酶切鑒定后進(jìn)行DNA測序驗證；
　　 2.質(zhì)粒pBudCE4.1-VP1表達(dá)：將質(zhì)粒pBudCE4.1-VP1轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，采用Western blotting和間接免疫熒光技術(shù)檢測VP1蛋白在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)；
　　 3.質(zhì)粒pBudCE4.1-VP1對細(xì)胞形態(tài)和活性的影響：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后，倒置顯微鏡連續(xù)觀察VP1蛋白對細(xì)胞形態(tài)的影響，通過MTT法檢測HeLa細(xì)胞的活性變化；
　　 4

3、.質(zhì)粒pBudCE4.1-VP1對高爾基體的影響：采用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)分析質(zhì)粒VP1蛋白對細(xì)胞高爾基體基質(zhì)蛋白GM130結(jié)構(gòu)的影響；
　　 5.質(zhì)粒pBudCE4.1-VP1對細(xì)胞周期的影響：以G1/S期為切入點，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測VP1轉(zhuǎn)染后16 h、20 h、24 h、28 h、32 h等時間點細(xì)胞周期的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.限制性內(nèi)切酶酶切和測序結(jié)果表明VP1已成功插入pBudCE4.1載體的多克

4、隆位點，其基因序列與CVB3m株(GI：323432)VP1基因序列完全一致。
　　 2.Western blotting和免疫熒光技術(shù)結(jié)果顯示：質(zhì)粒pBudCE4.1-VP1轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后能檢測到VP1蛋白的表達(dá)，且表達(dá)量隨轉(zhuǎn)染時間的延長而增加；
　　 3.質(zhì)粒pBudCE4.1-VP1轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后12 h，部分細(xì)胞開始變圓；隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，細(xì)胞出現(xiàn)較為明顯的病變效應(yīng)，到轉(zhuǎn)染48 h、60 h后，幾乎未見

5、正常細(xì)胞。MTT法結(jié)果顯示：質(zhì)粒VP1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與對照組細(xì)胞相比，OD值明顯降低(P<0.05)，且轉(zhuǎn)染時間越長，細(xì)胞活性越差；
　　 4.免疫熒光技術(shù)分析結(jié)果顯示：質(zhì)粒pBudCE4.1-VP1轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后，隨VP1蛋白表達(dá)量的增加，細(xì)胞蛋白GM130綠色熒光由帶狀分布趨于彌散，呈散在分布，且熒光強(qiáng)度減弱；
　　 5.細(xì)胞周期結(jié)果顯示：質(zhì)粒pBudCE4.1-VP1轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞16 h、20 h、24 h、2

6、8 h、32 h后，與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對照組G1期細(xì)胞相比，VP1轉(zhuǎn)染組G1期細(xì)胞分別升高到：58.81％(P<0.05)，57.15%(P<0.05)，54.87%(P<0.01)，55.46%(P<0.05)，56.96%(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功構(gòu)建CVB3 VP1基因真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-VP1，并能在HeLa細(xì)胞中表達(dá)；
　　 2.VP1蛋白作用于HeLa細(xì)胞后可引起明顯的細(xì)胞