卡維地洛抗血管形成及抑制肝纖維化的分子機制研究.pdf

1、纖維化是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結締組織異常增生，導致肝內(nèi)彌漫性細胞外基質(zhì)(ECM)過度沉淀的病理過程。我國每年有許多慢性肝炎患者最終發(fā)展為肝硬化。深入研究肝纖維化的發(fā)生機制，控制及逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進程具有重要的意義。目前普遍認為肝星狀細胞(HSC)的激活是肝纖維化形成初始的中心環(huán)節(jié)，并發(fā)現(xiàn)肝纖維化是可逆轉(zhuǎn)的。HSC的激活包括兩個步驟，即初始激活及持續(xù)激活。前者主要由旁分泌機制參與，而后者則既有旁分泌機制參與又有自分泌機制參與。HSC的激

2、活與多種細胞因子密切相關，其中血小板衍生因子(PDGF)及其信號系統(tǒng)具有極強的刺激HSC活化與有絲分裂作用，PDGF及其信號系統(tǒng)也是抗肝纖維化治療靶點之一。
　　血管生成是指機體生長發(fā)育過程中或創(chuàng)傷修復、缺血缺氧或炎癥等情況下，原有微血管內(nèi)皮細胞經(jīng)過生芽、遷移、增殖與基質(zhì)重塑等形成新毛細血管的過程。在肝纖維化進程中，除肝內(nèi)炎癥和ECM沉積外，還存在著血管增生及血管結構的重建，其中肝竇的毛細血管化會使其失去大量通透性極好的篩狀排列的

3、窗孔結構，影響肝細胞與血液之間進行活躍的物質(zhì)交換，加重肝細胞供能及供氧障礙，促進肝臟纖維化發(fā)展。近年來國外多項研究表明肝纖維化與肝臟血管生成有一定相關性。有報道抗血管生成治療可改善實驗動物的肝纖維化;目前亦普遍認為肝臟的血管新生與纖維化的形成是相互需求、相互促進的。肝星狀細胞與肝竇內(nèi)皮細胞之間的相互作用也一直是肝纖維化研究的熱點問題。
　　外泌體(exosome)是一類由多囊泡體或細胞膜產(chǎn)生的一類細胞外膜性小泡，其首要生物學功能是

4、進行細胞間聯(lián)絡。外泌體含有細胞特異性蛋白分子、mRNA及miRNAs等重要分子，通過將這些分子送達靶細胞而發(fā)揮細胞間聯(lián)絡作用。近年來有研究探索了外泌體在肝臟炎癥、纖維化和門脈高壓發(fā)病機理中的潛在作用。亦有假設提出肝硬化患者中外泌體產(chǎn)生有增高。然而外泌體是如何在靶細胞發(fā)揮作用的機制未明，特別是在內(nèi)皮細胞如何調(diào)控HSC遷移中的作用值得研究。
　　卡維地洛是第三代非選擇性β受體阻滯劑，兼有α1受體阻滯、抗氧化以及鈣通道拮抗活性。有報道提

5、示卡維地洛可減輕酒精或CCl4誘導的鼠肝纖維化，但其作用機制未見詳細闡述。亦有報道提示其類似物普萘洛爾具有抗血管形成作用?？傊?，卡維地洛可能具有抗肝纖維化及血管形成的作用，但缺乏研究及證據(jù)。
　　本研究首先觀察卡維地洛對肝星狀細胞(HSC)激活是否有直接抑制作用，接著研究了卡維地洛對內(nèi)皮細胞的功能影響。最后，我們研究了源于內(nèi)皮細胞的外泌體對HSC的激活作用及其機制?？傊?，我們研究了內(nèi)皮細胞與HSC相互作用促肝纖維化機制及藥物治療的

6、意義。
　　第一部分卡維地洛通過PDGFR/AKT通路抑制人肝星狀細胞的增殖及活化
　　目的：
　　以人肝星狀細胞系(LX-2)為研究對象，通過體外實驗研究卡維地洛對PDGF-BB誘導的HSC激活的影響，并進一步探討其內(nèi)在機制。
　　方法：
　　1.CCK8檢測細胞增殖水平
　　按實驗設計的分組（空白對照，陽性對照以及藥物處理）情況，將細胞分入96-孔培養(yǎng)板培養(yǎng)。24h后進行CCK8分析，檢測卡維地洛

7、對HSCs增殖的影響。
　　2.劃痕實驗檢測細胞遷移能力
　　按實驗分組將細胞接種于6孔板中，200μL滅菌移液器槍頭沿培養(yǎng)板劃直線，加入PDGF-BB及濃度梯度的卡維地洛處理24h后圖像采集。
　　3.使用Transwell進行侵襲能力測試
　　按實驗分組將細胞接種于鋪有基質(zhì)膠的Transwell小室上室，同時加入不同濃度的卡維地洛，下室加入PDGF-BB。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后取出上室，剪下底部膜染色，光學顯微鏡

8、下圖像采集并計數(shù)。
　　4.Real-time PCR和Western Blot檢測卡維地洛對LX-2纖維化相關指標表達水平的影響。
　　按實驗分組將細胞接種子6孔板中，藥物處理后提取細胞總RNA或蛋白，采用real-time PCR技術檢測LX-2中Ⅰ型膠原(Col1)和纖連蛋白(FN)的mRNA表達水平。Western Blot檢測FN和α-SMA蛋白表達水平。
　　5.Western Blot檢測卡維地洛對LX-

9、2通路相關蛋白的影響。按實驗分組將細胞接種于6孔板中，藥物處理后提取細胞總蛋白，利用Western blot技術檢測信號通路相關蛋白（PDGFRβ、PI3K、Akt及Erk）蛋白表達或磷酸化水平。
　　結果：
　　1.卡維地洛可抑制HSCs增殖。
　　CCK-8細胞增殖能力檢測實驗顯示，卡維地洛明顯抑制了HSCs的增殖能力，呈濃度依賴性。IC50=28.42μM。
　　2.卡維地洛抑制了HSCs的遷移能力和侵襲能

10、力。
　　劃痕實驗和侵襲實驗結果分別顯示，PDGF-BB可誘導HSCs遷移能力和侵襲能力增加，卡維地洛處理后的HSCs遷移能力和侵襲能力隨濃度增加逐漸減弱。
　　3.卡維地洛抑制了PDGF-BB誘導的HSC纖維化作用。
　　Real-time PCR和Western Blot結果顯示，PDGF-BB可誘導HSCs中Col1和FN的mRNA表達水平增高，F(xiàn)N和α-SMA的蛋白表達水平增高，卡維地洛處理可抑制這種增高。

11、r>　　4.PDGFR/Akt通路介導了卡維地洛的抗纖維化作用。
　　Western Blot結果顯示，PDGF-BB可誘導HSCs中PDGFRβ(Tyr751)和Akt磷酸化增高，卡維地洛可抑制這種增高，PDGF-BB可輕度增高PI3K表達，但卡維地洛對PI3K表達無明顯影響。
　　結論：
　　1.卡維地洛可抑制HSCs增殖。
　　2.卡維地洛可抑制PDGF-BB誘導的HSCs的遷移、侵襲作用。
　　3.

12、卡維地洛可抑制PDGF-BB誘導的HSCs纖維化作用。
　　4.卡維地洛對HSCs纖維化作用的影響可能通過PDGFR/Akt通路發(fā)揮作用。
　　第二部分卡維地洛通過抗血管形成對肝纖維化的作用研究
　　目的：
　　觀察卡維地洛對臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)功能及血管形成作用的影響，并進一步研究其內(nèi)在機制，同時觀察卡維地洛對其鞘氨醇激酶脂酶1(SK1)表達的影響。
　　方法：
　　1.CCK8檢測細胞增殖

13、水平
　　按實驗設計的分組（空白對照，陽性對照以及藥物處理）情況，將細胞分入96-孔培養(yǎng)板培養(yǎng)。24h后進行CCK8分析，檢測卡維地洛對HUVEC增殖的影響。
　　2.流式細胞儀檢測細胞周期。
　　按實驗分組將細胞接種于培養(yǎng)皿中，不同濃度的卡維地洛處理后胰酶(無EDTA)消化，冰PBS洗細胞，預冷乙醇固定細胞，溴化乙錠(PI)及RNase A避光染色后使用流式細胞儀進行分析。
　　3.劃痕實驗和Transwell

14、實驗檢測細胞遷移和侵襲能力
　　按實驗分組將細胞接種于6孔板中，200μL滅菌移液器槍頭沿培養(yǎng)板劃直線，加入VEGF及濃度梯度的卡維地洛處理24h后圖像采集。按實驗分組將細胞接種于鋪有基質(zhì)膠的Transwell小室上室，同時加入不同濃度的卡維地洛，下室加入VEGF。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后取出上室，剪下底部膜染色，光學顯微鏡下圖像采集并計數(shù)。
　　4.成管實驗進行血管形成能力檢測。
　　按實驗分組將細胞接種于鋪好基質(zhì)膠的96

15、孔板，加入VEGF和濃度梯度的卡維地洛處理8-12h后采集圖像。
　　5.Western blot檢驗信號通路關鍵蛋白變化
　　按實驗分組將細胞接種于6孔板中，加入不同濃度的卡維地洛和VEGF處理后，提取細胞蛋白，利用Western blot實驗檢測VEGFR-2、Erk和Src蛋白磷酸化水平的改變。
　　6.Real-time PCR及Western blot檢驗細胞SK1表達水平
　　不同濃度的卡維地洛和VE

16、GF處理后的細胞分別提取RNA及總蛋白，分別利用real-time PCR及Western blot檢測卡維地洛對HUVEC中SK1的mRNA及蛋白表達水平的影響。
　　結果：
　　1.卡維地洛可抑制HUVECs增殖。
　　CCK-8細胞增殖能力檢測實驗顯示，卡維地洛明顯抑制了HUVECs的增殖能力，呈濃度依賴性。IC50=38.5μM。
　　2.卡維地洛誘導了HUVECs的G1期停滯。
　　流式細胞儀檢測

17、細胞周期結果顯示:卡維地洛處理HUVECs后造成細胞G0/G1期延長(P＜0.05 vs control)，伴隨S和M期的縮短。
　　3.卡維地洛抑制了HUVECs的遷移能力和侵襲能力。
　　劃痕實驗和侵襲實驗結果分別顯示，VEGF可誘導HUVEC遷移能力和侵襲能力增加，卡維地洛處理后的HUVECs遷移能力和侵襲能力隨濃度增加逐漸減弱。
　　4.卡維地洛抑制了HUVECs血管形成能力。
　　成管實驗結果顯示，VE

18、GF可誘導HUVECs于基質(zhì)膠形成豐富管樣結構，卡維地洛處理后的HUVECs成管能力隨濃度增加逐漸減弱。
　　5.VEGFR2/Src/ERK通路介導了卡維地洛的抗血管形成作用。
　　Western Blot結果顯示，VEGF可誘導VEGFR-2、ERK1/2和Src磷酸化增高，卡維地洛可抑制這種磷酸化程度的增高，Src激酶抑制劑(PP2)亦可抑制VEGF誘導的ERK1/2磷酸化。
　　6.卡維地洛抑制了HUVECs的

19、SK1表達。
　　結果顯示，VEGF誘導了HUVECs巾SK1 mRNA和蛋白水平的增高，卡維地洛處理后抑制了這種增高。
　　結論：
　　1.卡維地洛可抑制HUVECs的增殖并誘導細胞周期停滯。
　　2.卡維地洛可抑制VEGF誘導的HUVECs的遷移、侵襲和血管形成作用。
　　3.VEGFR2/Src/ERK通路可能是卡維地洛的抗血管形成作用機制。
　　4.卡維地洛抑制了HUVECs的SK1表達，可能

20、從而抑制了內(nèi)皮細胞對肝星狀細胞的旁分泌作用。
　　第三部分外泌體對肝曼狀細胞遷移能力的作用及機制研究
　　目的：
　　研究來源于內(nèi)皮細胞的外泌體是否可通過旁分泌作用于肝星狀細胞，并影響其生物學功能。
　　方法：
　　1.小鼠肝竇內(nèi)皮細胞(LEC)的分離
　　肝組織經(jīng)灌注、收集、切開、剪碎、膠原酶緩沖液消化、與免疫磁珠結合、分離細胞后，種入含Ⅰ型膠原的培養(yǎng)皿。標準細胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)。
　　2.慢病毒

21、轉(zhuǎn)染產(chǎn)生穩(wěn)定細胞系
　　設計SK1顯性失活突變(D81A)模板和SK1組成性激活突變(G113A)模板。利用293T細胞產(chǎn)生慢病毒并轉(zhuǎn)導入TSEC形成表達SK1野生型、SK1 D81A突變和G113A突變的穩(wěn)定細胞系。并分別從此三種細胞系的條件培養(yǎng)基中提取外泌體。
　　3.外泌體純化
　　分別從血清和細胞培養(yǎng)上清中采用梯度離心法提取外泌體。采用WesternBlot、納米顆粒追蹤分析和電鏡免疫金標記對外泌體進行鑒定。<

22、br>　　4.免疫熒光、共聚焦顯微鏡和圖片定量
　　4％多聚甲醛固定細胞，封閉，一抗孵育，洗片，二抗孵育，洗片，DAPI染核，洗片，封片液封片后置于熒光共聚焦顯微鏡下進行圖像采集。
　　5.納米顆粒追蹤分析
　　外泌體樣本以4-8×108個/mL濃度裝載入NanoSight NS300設備，記錄3段30s視頻，進而分析囊泡的外觀、大小和密度進行。
　　6.Western Blot及Real-time PCR

23、>　　常規(guī)方法進行Western Blot及Real-time PCR檢測。
　　7.Transwell遷移實驗
　　通過Transwell小室檢測外泌體及各類成分對HSC遷移能力的影響。
　　8.透射電子顯微鏡和免疫金標
　　樣本經(jīng)多聚甲醛固定、載入電鏡網(wǎng)格、洗滌、一抗孵育、洗滌、金標二抗孵育洗滌、戊二醛固定、染色后使用透射電鏡觀察并采集圖像。
　　9.掃描電子顯微鏡
　　樣本經(jīng)固定、洗滌、再固定、

24、脫水、干燥、封片、濺射鍍膜后使用掃描電鏡觀察并采集圖像。
　　10.生物素分析法檢測細胞膜表面整合素活性
　　外泌體處理細胞后，使用生物素對細胞表面蛋白進行標記，收集裂解液并與蛋白G瓊脂糖珠結合后獲得蛋白樣本，常規(guī)Western Blot法檢測目的蛋白。
　　11.動物處理
　　C57BL/6小鼠接受CCl4腹腔注射或膽總管結扎手術建立肝纖維化模型。同時根據(jù)具體需要給予相應藥物處理。
　　12.天狼猩紅染色

25、
　　肝組織石蠟切片脫蠟后使用天狼猩紅+固綠染液染色，脫水封片后光鏡下圖像采集。
　　結果：
　　1.我們提取的外泌體特點為:直徑80-100nm，杯狀雙層膜形態(tài)，CD81、TfR和CD63免疫金染色陽性， WB檢測到TSG101、TfR、CD63等特征性外泌體標志物。微陣列分析顯示成纖維細胞生長因子(FGF)-2會誘導EC中SK1mRNA水平增高2.4倍。
　　2.外泌體處理HSC后會同時造成AKT磷酸化8.3

26、倍增高和遷移的2.5倍增加。SK1過表達EC細胞系來源的外泌體會使HSC遷移增高3.2倍。顯性失活SK1細胞的外泌體不能誘導HSC遷移。
　　3.Western Blot和透射電鏡發(fā)現(xiàn)外泌體表達基質(zhì)蛋白和整合素配體FN。通過CD20中和抗體或RGD肽阻斷FN與整合素相互作用后，外泌體誘導的HSCAKT磷酸化和遷移降低。
　　4.通過發(fā)動蛋白siRNA轉(zhuǎn)染、發(fā)動蛋白GTP酶顯性失活結構DynK44A轉(zhuǎn)染或藥理學抑制劑Dynas

27、ore抑制內(nèi)吞作用后，外泌體誘導的AKT磷酸化明顯降低。外泌體內(nèi)吞入細胞后，先出現(xiàn)在早期內(nèi)吞體，隨后出現(xiàn)在溶酶體區(qū)域。
　　5.肝纖維化模型小鼠血清來源外泌體中SK1水平增高，肝硬化患者肝組織中SK1 mRNA水平有2.5倍增高。
　　6.S1PR2抑制可保護CCl4引起的小鼠肝纖維化。
　　結論：
　　內(nèi)皮細胞來源的含SK1的外泌體可通過依賴FN-整合素的粘附和依賴發(fā)動蛋白的內(nèi)吞調(diào)節(jié)HSC的信號轉(zhuǎn)導和遷移。外泌