JNK信號通路在慢性乙型肝炎患者PBMC凋亡中的作用.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus， HBV)易致慢性化感染，但其慢性化機制尚不完全清楚。許多研究已經(jīng)證實慢性乙型肝炎(chronic viral hepatitisB， CHB)的發(fā)病機制與機體的細胞免疫功能低下密切相關，但CHB患者細胞免疫功能低下的機制尚未完全闡明，近年來有研究提出與淋巴細胞的激活誘導細胞死亡(activation induced cell death， AICD)有關。AICD是指已活化的成熟淋巴細

2、胞(T或B)再次受到激活信號激活后（特別是TCR/CD3復合體）所發(fā)生的細胞凋亡，這是維持機體免疫穩(wěn)定的一種生理機制，也可能是形成外周免疫耐受的重要原因。外周血單個核細胞(peripheral bloodmononuclear cells， PBMC)主要由淋巴細胞組成，還包括單核巨噬細胞、自然殺傷細胞等免疫活性細胞，在機體的免疫反應特別是細胞免疫反應中起重要的作用，檢測PBMC凋亡狀況可大體反映外周血淋巴細胞凋亡狀況。有研究發(fā)現(xiàn)CHB

3、患者外周血淋巴細胞和PBMC發(fā)生AICD的比率比正常對照高，提示淋巴細胞可能在HBV特異性抗原刺激下被激活，再發(fā)生自身凋亡(即AICD)，使淋巴細胞的數(shù)量減少或活性下降，從而導致CHB患者細胞免疫功能低下，這可能是導致HBV持續(xù)慢性感染的一個重要因素，也是形成HBV慢性感染免疫耐受的一個重要機制。因此如何通過調(diào)節(jié)AICD來減少淋巴細胞凋亡，改善CHB患者的細胞免疫功能，將是打破免疫耐受狀態(tài)、清除慢性乙型肝炎患者體內(nèi)HBV的可能途徑。但是

4、關于CHB患者PBMC發(fā)生AICD的機制尚未完全闡明，目前關于其凋亡途徑的研究主要集中于由Fas/FasL等介導的死亡受體凋亡途徑和Bcl-2家族調(diào)控的線粒體凋亡途徑，認為死亡受體途徑和線粒體途徑可能在CHB患者PBMC的AICD過程中起著重要的作用。
　　 c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase， JNK)家族是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase

5、， MAPK)超家族成員之一，也被稱為應激活化蛋白激酶(stress-activated MAP kinase， SAPK)，其上游雙特異性激酶MEK4/7通過雙磷酸化JNK的Thr183和Tyr185位點而激活JNK，磷酸化JNK(p-JNK)是其活性形式。JNK能介導多種胞外刺激（如應激、Fas、TNFα等）誘導的細胞凋亡，參與了許多細胞凋亡的發(fā)生，在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。目前認為JNK介導凋亡的機制主要是能通過轉(zhuǎn)錄依賴或

6、非轉(zhuǎn)錄依賴的方式調(diào)控下游凋亡相關靶基因的表達或靶蛋白的活性而介導死亡受體途徑及線粒體途徑的細胞凋亡。c-Jun和Bim都是JNK介導的細胞凋亡信號通路中的重要下游分子。c-Jun是核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子AP-1蛋白的一員，是第一個被發(fā)現(xiàn)的JNK核內(nèi)底物，磷酸化c-Jun(p-c-Jun)是其活性形式?；罨腏NK(p-JNK)轉(zhuǎn)位到細胞核后能夠使c-Jun第63、73位絲氨酸雙磷酸化而激活，從而提高其轉(zhuǎn)錄活性，促進下游凋亡相關靶基因的轉(zhuǎn)錄和凋亡蛋

7、白的表達（如FasL、Bim、c-myc等），分別啟動死亡受體途徑及線粒體途徑的細胞凋亡。Bim是Bcl-2家族中BH3-only亞家族的成員，是一種重要的凋亡調(diào)節(jié)蛋白。JNK被活化后可以從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位入核通過激活轉(zhuǎn)錄因子c-Jun而上調(diào)Bim的表達，也可以在胞質(zhì)內(nèi)直接使Bim蛋白磷酸化而誘發(fā)線粒體途徑的細胞凋亡。
　　 近年來研究證明JNK信號通路參與介導了多種疾病淋巴細胞的AICD過程。Mehrotras等發(fā)現(xiàn)應用JNK特異性抑

8、制劑SP600125可以對抗流感表位特異性CTL發(fā)生的AICD，說明JNK參與介導了流感表位特異性CTL的AICD過程。有研究發(fā)現(xiàn)JNK參與介導了小鼠脾臟T細胞的AICD過程。但是關于JNK信號通路是否也參與介導了CHB患者PBMC的AICD過程還未見報道。為此我們以CHB患者PBMC為研究對象，體外模擬AICD過程，觀察JNK通路的p-JNK、總JNK及其下游轉(zhuǎn)錄因子p-c-jun和下游蛋白Bim的表達情況和PBMC的凋亡率，以及在J

9、NK特異性抑制劑SP600125抑制JNK后，p-JNK、總JNK及其下游p-c-jun、Bim蛋白的表達和PBMC凋亡率的變化，來探討JNK信號通路在CHB患者外周血單個核細胞AICD過程中的作用。
　　 目的：
　　 研究JNK信號通路在慢性乙型肝炎患者外周血單個核細胞AICD過程中的作用，進一步探討AICD發(fā)生的機制，為慢性乙型肝炎的治療提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1 入選標準和排除標準

10、r>　　 選取慢性乙型肝炎患者共40例，其中男性22例，女性18例，年齡在18歲-60歲，平均年齡35歲。隨機分為兩組，慢性乙肝組20例，慢性乙肝+抑制劑組20例。所有病例診斷標準均符合2005年中華醫(yī)學會制定的“慢性乙型肝炎防治指南”，HBVDNA大于1×103copies/ml小于1×107copies/ml，ALT兩倍以上升高。排除應用過抗病毒藥物的患者，排除HAV、HCV、HDV、HEV和HIV感染，排除近3個月應用糖皮質(zhì)激素

11、、干擾素等影響免疫功能藥物的患者，除外有近期急性感染患者。健康對照組20例，男12例，女8例，年齡在18歲-45歲，平均年齡30歲，取自健康獻血員。
　　 2 PBMC的提取和培養(yǎng)
　　 無菌條件下抽取肝素抗凝血4mL，應用密度梯度離心法分離PBMC。分離成功的PBMC加入植物血凝素(Phytohemagglutinin，PHA)100μg/ml刺激培養(yǎng)16-18小時，棄去PHA，加入外源性IL-21000U/L進行培養(yǎng)

12、至少7天后，用抗CD3抗體500ug/ml重新刺激48小時。慢性乙肝+抑制劑組在加抗CD3抗體前用JNK特異性抑制劑SP60012520μmol/l預處理2小時。
　　 3 細胞凋亡的檢測
　　 培養(yǎng)的細胞用70％乙醇固定，4℃離心去掉固定液，并用冷PBS洗2次，加入含有RaseA的PI染液約1000μL，室溫靜置30分鐘后上流式細胞儀檢測凋亡率。
　　 4 p-JNK、總JNK、p-c-jun、Bim蛋白的檢測

13、：
　　 剩余細胞，提取蛋白后，-80℃保存，待收集夠標本后集中行Westernblot檢測p-JNK、總JNK、p-c-jun、Bim蛋白的表達情況。
　　 結(jié)果：
　　 1 經(jīng)抗CD3抗體刺激48h后，慢性乙肝組PBMC凋亡率(28.27％±4.61％)高于健康對照組（19.36％±5.90％），差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，也高于慢性乙肝+抑制劑組(23.37％±5.52％)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.

14、05)。慢性乙肝+抑制劑組PBMC凋亡率（23.37％±5.52％）高于健康對照組(19.36％±5.90％)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 2 慢性乙肝組PBMC中p-JNK蛋白的表達量高于健康對照組(1.09±0.16vs0.83±0.12，t=5.885，P＜0.01)，也高于慢性乙肝+抑制劑組(1.09±0.16vs0.53±0.15，t=11.502，P＜0.01)，差異有統(tǒng)計學意義?？侸NK蛋白在三個組的

15、表達差異無統(tǒng)計學意義。慢性乙肝組PBMC中p-c-jun蛋白的表達量高于健康對照組(1.21±0.15vs0.96±0.13，t=5.477，P＜0.01)，也高于慢性乙肝+抑制劑組(1.21±0.15vs0.62±0.14，t=12.899，P＜0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。慢性乙肝組PBMC中Bim蛋白的表達量高于健康對照組(0.96±0.14vs0.58±0.12，t=9.133，P＜0.01)，也高于慢性乙肝+抑制劑組(0.96

16、±0.14vs0.52±0.13，t=10.086，P＜0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。
　　 3 慢性乙肝組PBMC凋亡率與PBMC中p-JNK蛋白的表達成正相關(r=0.823，P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1 慢性乙型肝炎患者PBMC存在AICD現(xiàn)象，且凋亡率較正常人高。
　　 2 慢性乙型肝炎患者PBMC中存在JNK信號通路的過度激活。
　　 3 慢性乙型肝炎患者PBMC凋亡率與PB