版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
1、人細(xì)小病毒B19(human parvovirus b19, PVB19)是細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬中目前已知的唯一致人類疾病的病毒,也是動(dòng)物病毒中體積最小結(jié)構(gòu)最簡單的DNA 病毒?,F(xiàn)已證實(shí)該病毒與多種兒童及成人疾病有關(guān)。1990 年我科首次證實(shí)國內(nèi)存在該病毒感染,隨后的研究發(fā)現(xiàn)其是我國兒童急性再生障礙性貧血、急性血小板減少性紫癜、胎兒水腫及孕婦非免疫性流產(chǎn)等疾病的重要病因之一,并與先天性心臟病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)發(fā)病相關(guān)。 B1
2、9 病毒是由5.6Kb 核苷酸組成,編碼一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1)和兩個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1, VP2)。B19 病毒殼蛋白主要由VP2 蛋白組成,VP1 蛋白不超過殼蛋白的10%,其獨(dú)特區(qū)暴露在病毒的表面。B19 病毒的抗原表位區(qū)集中在VP1獨(dú)特區(qū)和VP1-VP2 連接區(qū)。只有VP1 獨(dú)特區(qū)和VP1-VP2 連接區(qū)基因編碼的蛋白才能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體。非結(jié)構(gòu)蛋白NS和B19病毒毒力有關(guān)。VP1和VP2 蛋白,特別是VP1 獨(dú)特區(qū),對B1
3、9 病毒的診斷和保護(hù)性疫苗的制備非常有意義。 但是,由于B19 病毒不能在傳統(tǒng)的培養(yǎng)基上生長繁殖,使B19 病毒抗原來源十分困難;加之XA 株B19 病毒VP1 獨(dú)特區(qū)在核苷酸水平和氨基酸水平上與標(biāo)準(zhǔn)株相比存在著顯著的差異,故需要大量制備中國株B19 病毒VP1 蛋白作為抗原,為制備特異性診斷試劑和疫苗創(chuàng)造條件。 研究目的: 本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)是在構(gòu)建B19病毒VP1基因原核表達(dá)載體基礎(chǔ)上大量表達(dá)VP1蛋白,進(jìn)一步對VP1
4、 蛋白進(jìn)行純化,以純化蛋白作為免疫原免疫動(dòng)物制備其單克隆抗體,檢測VP1 蛋白的免疫原性及其單克隆抗體的免疫活性,為以后研究VP1 蛋白的生物學(xué)功能,和B19 病毒的防治奠定基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法: 1.首先通過酶切、電泳鑒定我們已構(gòu)建的VP1-PUC19 質(zhì)粒,將VP1 片斷連接質(zhì)粒PQE30,用氯化鈣法制備和轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15,送菌測序。 2.運(yùn)用IPTG 誘導(dǎo)含有VP1-PQE30 質(zhì)粒的發(fā)酵培養(yǎng)菌株表達(dá)VP1
5、融合蛋白,并通過SDS-PAGE 和Western-blot 技術(shù)分析蛋白表達(dá)情況及鑒定表達(dá)蛋白,利用AKTA explorer 100 快速純化系統(tǒng)純化表達(dá)蛋白。 3.以純化的蛋白作為抗原,免疫BALB/c 小鼠,末次加強(qiáng)免疫后3d 取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0 進(jìn)行融合,經(jīng)HAT 選擇培養(yǎng),通過ELISA 反復(fù)篩選陽性克隆,有限稀釋法進(jìn)行5 次以上的亞克隆,得到的穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株后用Western-bl
6、ot 鑒定其特異性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1.VPl-PUC19 經(jīng)BamHI 和SalI 雙酶切可切出分子量約480bp 的片段,與預(yù)期結(jié)果相符。轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌M15 測序結(jié)果證實(shí)序列完全正確。 2.含有VP1-PQE30 質(zhì)粒的菌株經(jīng)誘導(dǎo)劑IPTG 誘導(dǎo),可表達(dá)分子量約為22KD 的蛋白,經(jīng)Western-blot 鑒定,均可與6-His 抗體結(jié)合,為VP1 融合蛋白。 3.經(jīng)AKTA explorer 1
7、00 快速純化系統(tǒng)純化表達(dá)的融合蛋白,收獲復(fù)性蛋白75g,純度達(dá)95%以上。 4.反復(fù)篩選獲得兩株穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株:LI 和ZH;Western- blot 結(jié)果顯示該單抗有較強(qiáng)的特異性。 結(jié)論: 1. 成功構(gòu)建了人細(xì)小病毒B19 XA 株VPl 基因的原核表達(dá)系統(tǒng)VP1-PQE30-M15. 2. 用發(fā)酵罐培養(yǎng)含有VP1-PQE30 的大腸桿菌M15,可誘導(dǎo)B19 病毒VP1蛋白大量表達(dá)
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 人細(xì)小病毒B19 VP1獨(dú)特區(qū)蛋白對心肌細(xì)胞的影響及機(jī)制.pdf
- 人細(xì)小病毒B19結(jié)構(gòu)蛋白VP1獨(dú)特區(qū)多克隆抗體的制備及其磷脂酶A2活性的研究.pdf
- 人細(xì)小病毒B19VP2蛋白的優(yōu)勢表達(dá)與抗原活性檢測.pdf
- 細(xì)小病毒B19結(jié)構(gòu)蛋白VP1獨(dú)特區(qū)和VP1-VP2共同區(qū)主要抗原片段的原核表達(dá)、純化及血清學(xué)應(yīng)用研究.pdf
- 人細(xì)小病毒B19-XA2株VP1蛋白Bac-to-Bac系統(tǒng)表達(dá)及免疫學(xué)特性分析.pdf
- 人細(xì)小病毒B19病毒樣顆粒的制備.pdf
- 人細(xì)小病毒B19與過期流產(chǎn)的關(guān)系研究.pdf
- 人細(xì)小病毒B19抗體檢測方法的建立.pdf
- 人細(xì)小病毒B19中國株NS1蛋白基因全長的克隆及融合蛋白的表達(dá).pdf
- 小兒造血系統(tǒng)疾病細(xì)小病毒b19感染
- 人細(xì)小病毒B19中國株NS蛋白基因克隆及序列分析.pdf
- 兒童細(xì)小病毒B19感染診斷方法及臨床特征的研究.pdf
- 人細(xì)小病毒B19 Real-time PCR檢測方法的建立及應(yīng)用.pdf
- 人類細(xì)小病毒B19基因組NS1、VP1和VP2基因克隆及對宿主Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的影響研究.pdf
- 細(xì)小病毒B19檢測基因芯片的制備及初步研究.pdf
- 血源性人細(xì)小病毒核酸檢測體系建立與人細(xì)小病毒B19分子特性分析.pdf
- 原料血漿中人細(xì)小病毒B19與細(xì)小病毒4核酸檢測體系的建立及風(fēng)險(xiǎn)初步評估.pdf
- 血液制品人細(xì)小病毒B19污染情況調(diào)查及新型病毒滅活方法研究.pdf
- 人細(xì)小病毒B19中國株VPI蛋白獨(dú)特區(qū)基因片段克隆及序列分析.pdf
- 武漢地區(qū)呼吸道感染兒童人細(xì)小病毒B19檢測及臨床意義.pdf
評論
0/150
提交評論