血源性人細(xì)小病毒核酸檢測(cè)體系建立與人細(xì)小病毒B19分子特性分析.pdf

1、血液制品的病毒安全性一直是倍受關(guān)注的熱點(diǎn)問題。隨著輸血傳播病毒篩查技術(shù)以及病毒滅活/去除技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用，人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）及丙型肝炎病毒（hepatitis Cvirus，HCV）等對(duì)血液制品安全的威脅已極大降低。人細(xì)小病毒B19（human parvovirus B19，B19病毒）和人細(xì)小病毒4（human p

2、arvovirus4，PARV4）成為了新的威脅血液制品安全性的病原體，近年來日益引起人們的關(guān)注。
　　為降低B19病毒經(jīng)血液制品傳播的潛在風(fēng)險(xiǎn)，國際組織及發(fā)達(dá)國家均采取了一系列監(jiān)控措施，建議/要求在血液制品生產(chǎn)過程中使用B19病毒核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)（nucleic acid amplification technology，NAT）作為在線控制措施，保證用于血液制品生產(chǎn)的混合原料血漿中B19病毒載量不高于104 IU/mL。PAR

3、V4因其生物學(xué)特性、理化特性等與B19病毒高度相似而引起關(guān)注，其也有可能通過血液制品輸注途徑傳播，但國外尚未制定相關(guān)監(jiān)控措施及標(biāo)準(zhǔn)。我國目前對(duì)于原料血漿中細(xì)小病毒的監(jiān)控尚無任何相關(guān)文件和技術(shù)指導(dǎo)原則，對(duì)于獻(xiàn)血/獻(xiàn)漿人群中細(xì)小病毒的攜帶情況以及原料血漿中的污染狀況缺乏足夠的基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)，也沒有對(duì)國內(nèi)現(xiàn)有毒株特性進(jìn)行系統(tǒng)分析。根據(jù)以上研究背景，結(jié)合我國實(shí)際情況，本研究主要進(jìn)行了以下幾方面工作：
　?。?）人細(xì)小病毒B19通用核酸檢測(cè)體系

4、中競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)的優(yōu)化與評(píng)價(jià)
　　在前期建立的基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（fluorescence-based quantitative real-time PCR，qPCR）的B19病毒通用核酸檢測(cè)體系基礎(chǔ)上，對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)的構(gòu)建方法進(jìn)行優(yōu)化。將競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增片段克隆到M13mp18噬菌體載體中，轉(zhuǎn)染XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞獲得了噬菌體蛋白包裹單鏈DNA的競(jìng)爭(zhēng)性噬菌體內(nèi)標(biāo)M13mp18-IC，并確定了該內(nèi)標(biāo)在血漿樣品中的最佳添加濃

5、度為10 copies/μL。最后對(duì)添加內(nèi)標(biāo)的B19病毒檢測(cè)體系分別進(jìn)行了敏感性、特異性、重復(fù)性和準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，B19病毒通用核酸檢測(cè)體系的定量下限可達(dá)10 copies/μL，即可對(duì)病毒載量低至492 IU/mL的血漿中B19病毒核酸進(jìn)行準(zhǔn)確定量；與其他經(jīng)血傳播病毒均無交叉反應(yīng)；5×107~5×101 copies/μL濃度范圍內(nèi)，B19病毒參考品質(zhì)粒在批內(nèi)和批間重復(fù)實(shí)驗(yàn)中各濃度質(zhì)粒的Cq值變異系數(shù)均小于2％，批內(nèi)和批間實(shí)驗(yàn)中

6、，各濃度B19病毒參考品質(zhì)粒的拷貝數(shù)平均變異系數(shù)分別為8.60%和9.17%；1×108~1×104 copies/μL濃度范圍內(nèi)，B19病毒通用核酸檢測(cè)體系具有高度準(zhǔn)確性（斜率=1.005）。
　　本研究建立的 B19病毒通用核酸檢測(cè)體系，既有良好的敏感性、特異性、重復(fù)性和準(zhǔn)確性，又可有效的避免因核酸提取和/或抑制物存在等所導(dǎo)致的假陰性檢測(cè)結(jié)果，可用于將來對(duì)血液制品生產(chǎn)用混合原料血漿的B19病毒NAT篩查，對(duì)于保障我國血液制品安

7、全性具有重要意義。此外，此檢測(cè)體系還可應(yīng)用于B19病毒感染的早期診斷，為下一步B19病毒診斷試劑盒的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
　　（2）人細(xì)小病毒B19-人細(xì)小病毒4雙重核酸檢測(cè)體系的建立與評(píng)價(jià)
　　首先分別合成B19病毒、PARV4的通用檢測(cè)引物與探針，根據(jù)輔助噬菌體M13K07序列設(shè)計(jì)和合成非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)引物與探針，并合成或構(gòu)建 B19病毒、PARV4和非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)的參考品質(zhì)粒。然后分別對(duì)B19病毒和PARV4的qPCR的退

8、火溫度、探針濃度和引物濃度以及反應(yīng)體系中MgCl2+濃度等進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳反應(yīng)體系和條件。確定非競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)標(biāo)在血漿樣品中的最佳添加濃度（2.5 copies/μL）后，對(duì)雙重核酸檢測(cè)體系分別進(jìn)行了敏感性、特異性和重復(fù)性評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示B19病毒和PARV4檢測(cè)下限均可達(dá)5 copies/μL；與其他經(jīng)血傳播病毒均無交叉反應(yīng)；5×106~5×101 copies/μL濃度范圍內(nèi)，B19病毒和 PARV4參考品質(zhì)粒在批內(nèi)和批間重復(fù)實(shí)驗(yàn)中各濃

9、度質(zhì)粒的 Cq值變異系數(shù)均小于2%；批內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，B19病毒和PARV4各濃度參考品質(zhì)?？截悢?shù)的平均變異系數(shù)分別為4.74%和5.97%，批間實(shí)驗(yàn)中平均變異系數(shù)分別為8.22%和12.29%。
　　本研究建立的B19病毒-PARV4雙重核酸檢測(cè)體系，既有較高的敏感性、特異性和重復(fù)性，又可有效的避免因核酸提取和/或抑制物存在等所導(dǎo)致的假陰性檢測(cè)結(jié)果。為進(jìn)行我國獻(xiàn)血/獻(xiàn)漿人群中B19病毒與PARV4的核酸檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。
　?。?

10、）我國獻(xiàn)血/獻(xiàn)漿人群中血源性人細(xì)小病毒的檢測(cè)
　　應(yīng)用本研究建立的B19病毒-PARV4雙重核酸檢測(cè)體系，對(duì)我國北京地區(qū)和西安地區(qū)共計(jì)1151份單人份獻(xiàn)血員血漿進(jìn)行B19病毒和PARV4核酸檢測(cè)。結(jié)果顯示，共有5份單人份血漿為B19病毒核酸陽性，總陽性率為0.43%，病毒載量為6.80×102~1.38×105 copies/mL；其中西安地區(qū)B19病毒DNA陽性率為0.3%（3/1000），北京地區(qū)陽性率為1.32%（2/151

11、）；而所有血漿均為PARV4核酸陰性。
　　應(yīng)用本研究建立的 B19病毒通用核酸檢測(cè)體系，對(duì)我國三家不同血液制品企業(yè)的共計(jì)235份混合原料血漿樣品進(jìn)行了B19病毒核酸檢測(cè)。結(jié)果顯示，169份（169/235，71.91%）樣品存在B19病毒污染，病毒載量為5.18×102~1.05×109 IU/mL；其中115份樣品（115/169，68.05%）的 B19病毒核酸陽性的樣品病毒載量高于104 IU/mL。
　　結(jié)果表明，

12、本研究中獻(xiàn)血人群的B19病毒和PARV4核酸陽性率和病毒載量均較低。但混合原料血漿中 B19病毒的污染率和污染程度相對(duì)較高，使得血液制品存在傳播 B19病毒的潛在風(fēng)險(xiǎn)，因此建議我國血液制品企業(yè)對(duì)原料血漿進(jìn)行B19病毒NAT篩查，對(duì)于保障血液制品的病毒安全性具有重要意義。
　　（4）我國獻(xiàn)血/漿人群中人細(xì)小病毒B19分子特性分析
　　對(duì)123份B19病毒核酸陽性血漿樣品進(jìn)行了B19病毒NS1-VP1u區(qū)的克隆和測(cè)序，與GenB

13、ank上的B19病毒參考序列多重比對(duì)后，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和重組分析。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，在我國至少有3種亞型（1a、1b和3b）的B19病毒傳播，其中1a亞型占主導(dǎo)地位（78/123，63.41%），其次為3b亞型（21/123，17.07%）和1b亞型（12/123，9.76%），沒有B19病毒2型的存在。重組分析結(jié)果顯示，有4個(gè)序列為B19病毒1a/3b重組型，5個(gè)序列中沒有檢測(cè)到重組信號(hào)，可能為B19病毒新的亞型。
　　此

14、外，對(duì)部分樣品中 B19病毒近全長序列進(jìn)行了克隆與測(cè)序，與 GenBank上的B19病毒參考序列多重比對(duì)后，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。共獲得6個(gè)B19病毒近全長序列，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示其均為B19病毒1a亞型。
　　本研究首次發(fā)現(xiàn)在我國至少有3種亞型B19病毒（1a、1b和3b）的流行，并首次發(fā)現(xiàn)B19病毒1a/3b重組型和可能新基因亞型的存在。有助于了解不同基因型B19病毒在我國的流行情況及其進(jìn)化趨勢(shì)，對(duì)于B19病毒感染的預(yù)防和控制以及保