冬凌草甲素及其納米混懸劑對人胰腺癌細胞PANC-1作用的比較研究.pdf

1、胰腺癌是常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率占人類全身腫瘤的1％～3％,消化道腫瘤的8％～10％。其惡性程度高,難于早期診斷。目前外科手術(shù)是根治胰腺癌的唯一方法,但在胰腺癌患者中,僅約20％可行手術(shù)治療,而接受根治性手術(shù)患者的5年生存率僅20％～25％,80％無法手術(shù)或有遠處轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者2年生存率為5％～18％,5年生存率為0～5％。因此,輔助治療尤其是化學治療(化療)對于改善進展期胰腺癌患者的生活質(zhì)量極為重要.同時在一定條件下可延長生存期,

2、并可能贏得手術(shù)機會。
　　 冬凌草甲素(oridonin)是從唇形科(Labtea)香茶菜屬(Rabdosia)植物中分離出的一種貝殼杉烯二萜類(ent-kaurene diterpenoid)天然有機化合物。研究發(fā)現(xiàn),冬凌草甲素具有較強的抗腫瘤活性,對多種腫瘤細胞具有抑制增殖和促凋亡作用。但由于其水溶性差,吸收率低,體內(nèi)生物半衰期短,目前有關(guān)制劑的臨床抗癌療效尚不理想。因此如何增加冬凌草甲素的水溶性、提高其生物利用度是亟待解決

3、的問題。
　　 納米混懸劑是適用于難溶性藥物的新劑型,系將藥物顆粒粉碎到納米級后懸浮于分散介質(zhì)中。其優(yōu)點是增加了藥物的溶解性并最終提高了藥物的釋放速率。與傳統(tǒng)意義上的基質(zhì)骨架型納米體系不同,納米混懸劑無需載體材料,有效避免了共溶劑的毒副作用以及環(huán)糊精對藥物分子大小的要求。納米混懸劑還能產(chǎn)生生物粘附性,增加藥物穩(wěn)定性從而提高藥效。
　　 本課題研究了冬凌草甲素原料藥及其納米混懸劑對人胰腺癌細胞PANC-1增殖和凋亡的影響及

4、其作用機制,進一步分析比較冬凌草甲素原料藥及其納米混懸劑作用效果的差異,以評價冬凌草甲素抗胰腺癌的效果以及冬凌草甲素納米混懸劑的應(yīng)用價值。研究結(jié)果為臨床藥物劑型的開發(fā)應(yīng)用提供了實驗依據(jù),同時對促進中藥現(xiàn)代化的發(fā)展也具有重要意義。
　　 第一部分
　　 冬凌草甲素及其納米混懸劑對PANC-1細胞生長的抑制作用
　　 [研究目的]檢測并比較冬凌草甲素及其納米混懸劑對PANC-1細胞增殖的抑制作用
　　 [研究

5、方法]
　　 (1)光學顯微鏡觀察不同濃度冬凌草甲素及其納米混懸劑對PANC-1細胞生長的影響。
　　 (2)MTT試驗檢測冬凌草甲素及其納米混懸劑對PANC-1細胞存活率的影響。
　　 [結(jié)果]
　　 (1)光學顯微鏡觀察可見,細胞在形態(tài)上的變化,細胞變圓皺縮,并且隨著冬凌草甲素濃度的增加,細胞數(shù)量逐漸減少。
　　 (2)MTT實驗結(jié)果顯示,細胞生長抑制率都隨給藥濃度的增加和用藥時間的延長逐漸升

6、高,呈明顯的劑量和時問依賴性。在相同用藥濃度下,冬凌草甲素納米混懸劑對PANC-1細胞的生長抑制作用效果更好。
　　 [結(jié)論]冬凌草甲素及其納米混懸劑對PANC-1細胞生長均有抑制作用,并且其混懸劑的抑制效果更明顯。
　　 第二部分
　　 冬凌草甲素及其納米混懸劑對PANC-1細胞凋亡的影響
　　 [研究目的]檢測比較冬凌草甲素及其納米混懸劑對PANC-1細胞凋亡的影響,探討凋亡機制。
　　 [研

7、究方法]
　　 (1)碘化丙啶(PI)染色和Hoechst33342染色法觀察不同濃度冬凌草甲素及其納米混懸劑作用于PANC-1細胞后,細胞的形態(tài)學變化。
　　 (2)膜聯(lián)蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ)／PI雙標流式細胞術(shù)測定不同濃度冬凌草甲素及其納米混懸劑對PANC-1細胞凋亡的影響。
　　 (3)分光光度法檢測冬凌草甲素及其納米混懸劑分別作用于PANC-1細胞不同時間后,Caspase-3酶活性的變化。
　

8、　 (4)Western blot法測定Caspase-3酶原(pro-caspase-3)、Bax和Bcl-2蛋白的表達變化。
　　 [結(jié)果]
　　 (1)PI染色和Hoechst33342染色結(jié)果顯示,冬凌草甲素及其納米混懸劑均能誘導(dǎo)PANC1細胞凋亡。
　　 (2)冬凌草甲素及其納米混懸劑對PANC-1細胞有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用,細胞凋亡率隨藥物濃度的增加而逐漸增加,冬凌草甲素納米混懸劑組的凋亡率更高。

9、r>　　 (3)Caspase-3酶活性檢測顯示,冬凌草甲素及其納米混懸劑作用于細胞后Caspase-3活性較對照組顯著增強。
　　 (4)Western blot結(jié)果顯示Caspase-3酶原被激活,Bax的表達增加,Bcl-2的表達無明顯變化。
　　 [結(jié)論]冬凌草甲素及其納米混懸劑均能誘導(dǎo)PANC-1細胞發(fā)生凋亡,并且納米混懸劑具有更好的誘導(dǎo)凋亡作用。其機制可能是通過改變Bax／Bcl-2的表達,繼而啟動casp

10、ase途徑誘導(dǎo)PANC-1細胞發(fā)生凋亡。
　　 第三部分
　　 冬凌草甲素及其納米混懸劑對PANC-1細胞周期的影響
　　 [研究目的]檢測比較冬凌草甲素及其納米混懸劑對PANC-1細胞周期分布的影響,探討其影響細胞周期分布的機制。
　　 [研究方法]
　　 (1)PI染色流式細胞術(shù)檢測不同濃度冬凌草甲素及其納米混懸劑對PANC-1細胞周期分布的影響。
　　 (2)Western Blot

11、檢測細胞周期相關(guān)蛋白CyclinB1、Cdc2和p-cdc2(T161)的表達變化。
　　 [結(jié)果]
　　 (1)冬凌草甲素及其納米混懸劑均可將PANC-1細胞周期阻滯在G2／M期,且納米混懸劑的阻滯作用更強。
　　 (2)CyclinB1和p-cdc2(T161)的表達隨藥物作用時間的延長而減少,Cdc2的表達無明顯變化。
　　 [結(jié)論]冬凌草甲素及其納米混懸劑均能夠抑制CyclinB1和p-ode2(

12、T161)的表達,使PANC-1細胞周期阻滯在G2／M期。
　　 上述三部分研究結(jié)果顯示,冬凌草甲素及其納米混懸劑均可通過G2／M細胞周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡抑制胰腺癌細胞PANC-1的生長,且納米混懸劑的作用更明顯。其促凋亡作用分子機制可能是通過改變Bax／Bcl-2的表達比率,激活Caspase-3,從而促進PANC-1細胞發(fā)生凋亡；G2／M細胞周期阻滯可能是通過降低CyclinB1和p-cdc2(T161)的表達而發(fā)揮作用的。<