PCF經(jīng)ROS-UCP2-cytoC信號通路對UVA誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞凋亡的調(diào)控.pdf

1、目的:復(fù)制8J·cm-2UVA輻射損傷HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡模型,探究線粒體解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)在UVA誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用,確定線粒體解偶聯(lián)蛋白2對活性氧的調(diào)控,從線粒體呼吸鏈復(fù)合酶、活性氧(ROS)、線粒體解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)、細(xì)胞色素C(cytoC)、凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)的角度,研究扇貝多肽(PCF)保護(hù)UVA誘導(dǎo)的HacaT細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。方法:復(fù)制8J·cm-2 UVA照射HaC

2、aT細(xì)胞后18h的最佳凋亡模型,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為:對照組、UVA模型組、PCF組(5.69,2.84,1.42 mmol·L-1PCF)、抑制劑組(5mmol·L-1 NAC)。采用瓊脂糖凝膠電泳法和Hochest33258熒光染色觀察UVA引起的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化及細(xì)胞凋亡率；2,7-二氯氫化熒光素二酯熒光探針,檢測PCF對UVA損傷細(xì)胞后ROS生成量的影響；RT-PCR檢測胞漿谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、過氧化氫酶(CAT)mRNA的

3、表達(dá)；免疫印跡法檢測胞漿超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD),UCP2,凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1),細(xì)胞色素C(cytoC)的蛋白表達(dá)；用紫外分光光度法測定呼吸鏈復(fù)合酶1(NADH:Q還原酶)的活性。結(jié)果:UVA模型組HaCaT細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡梯形條,細(xì)胞核發(fā)生明顯固縮,PCF組梯形條帶明顯減少同時(shí)還提高了Cu,Zn—SOD、GPx和CAT的表達(dá)；UVA輻射HaCaT細(xì)胞后18h凋亡模型細(xì)胞中的ROS含量明顯升高；1.42-5

4、.69 mmol·L-1劑量范圍內(nèi)的PCF可明顯抑制UVA引起的細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生；UVA模型組中UCP2的表達(dá)明顯增高而正常對照組及預(yù)先加入NAC活性氧清除劑的細(xì)胞中UCP2幾乎不表達(dá),1.42—5.69 mmol·L-1劑量范圍內(nèi)的PCF可劑量依賴性提高UCP2的蛋白表達(dá)；UVA模型組cytoC向胞漿的釋放量明顯增多,Apaf-1表達(dá)量升高1.42—5.69 mmol·L-1劑量范圍內(nèi)的PCF可明顯抑制cytoC向胞漿釋放及Apaf

5、-1蛋白的表達(dá)；UVA模型組呼吸連復(fù)合酶Ⅰ的活性明顯下降PCF組可以劑量依賴性提高復(fù)合酶的活性抑制UVA誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞凋亡。結(jié)論:PCF可以通過提高細(xì)胞內(nèi)的過氧化物酶(Cu,Zn-SOD、GPx和CAT)的表達(dá)抑制UVA誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞凋亡線粒體解耦蛋白2參與了UVA誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制,UVA輻射損傷HaCaT細(xì)胞,細(xì)胞中會產(chǎn)生大量的ROS,ROS可以激活UCP2的表達(dá),PCF可以經(jīng)ROS／UCP2／cytoC