VEGF啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的雙自殺基因治療大腸癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)研究目的：基因治療是惡性腫瘤治療的有效手段之一，但基因治療仍存在轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低、對(duì)腫瘤殺傷的作用不強(qiáng)、靶向性不高以及安全性等許多問(wèn)題，為了提高基因治療的靶向性及對(duì)腫瘤的殺傷作用，本研究利用已構(gòu)建好的攜有血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子啟動(dòng)子(VEGFP)并含有大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(CD)基因和Ⅰ型單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因的重組腺病毒(Ad)載體，在體外和體內(nèi)分別感染大腸癌LOVO細(xì)胞，并給予前藥進(jìn)行治療實(shí)驗(yàn)，以研究Ad-VEGFp-

2、CDglyTK基因治療系統(tǒng)對(duì)大腸癌細(xì)胞的體外殺傷作用和體內(nèi)抑瘤作用，同時(shí)對(duì)于該治療系統(tǒng)的安全性作初步探討，為進(jìn)一步開(kāi)展腫瘤的雙自殺基因治療和靶向治療探索新的道路。 實(shí)驗(yàn)研究方法：Ad-VEGFp-CDglyTK對(duì)大腸癌細(xì)胞的體外殺傷作用：分別復(fù)蘇和擴(kuò)增含有熒光蛋白(GFP)報(bào)告基因重組腺病毒Ad-VEGFp-CDglyTK、Ad-CMVp-CD、Ad-CMVp-TK、Ad-CMVp-CdglyTK，再用氯化銫密度梯度離心法純化重

3、組腺病毒，并進(jìn)行重組腺病毒的滴度測(cè)定，確認(rèn)每種重組腺病毒滴度在1×109pfu水平；然后用這些重組腺病毒分別感染大腸癌LOVO細(xì)胞，給予前藥5-氟胞嘧啶(5-FC)和更昔洛韋(GCV)進(jìn)行作用一定的時(shí)間，分別測(cè)定LOVO細(xì)胞的集落形成、細(xì)胞存活率及旁觀者效應(yīng)，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。 Ad-VEGFp-CDglyTK對(duì)大腸癌細(xì)胞的體內(nèi)抑瘤作用：將Lovo細(xì)胞0.2ml(5×107細(xì)胞.ml-1)接種于4周齡Balb/c裸鼠皮下建

4、立裸鼠大腸癌移植瘤動(dòng)物模型，微量注射器多點(diǎn)重復(fù)注射相應(yīng)的重組腺病毒，使重組腺病毒感染動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)的LOVO細(xì)胞，再向動(dòng)物模型腹腔內(nèi)注射5-FC和6CV進(jìn)行治療，連續(xù)治療14d，測(cè)量實(shí)體瘤重量變化、描出生長(zhǎng)曲線、按公式計(jì)算瘤體生長(zhǎng)抑制率，并取腫瘤組織和內(nèi)臟組織HE染色后在顯微鏡下觀察病理學(xué)變化，同時(shí)另取部分新鮮腫瘤組織切成2mm3小塊，電鏡常規(guī)包埋，超薄切片、染色，電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。 實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果：細(xì)胞克隆形成率：用Ad-

5、VEGFp-CDglyTK、Ad-CMVp-CDglyTK、Ad-CMVp-TK、Ad-CMVp-CD治療系統(tǒng)的細(xì)胞克隆形成率分別為15.58％、17.67％、22.67％、24.33％，Ad-VEGFp-CDglyTK治療系統(tǒng)、Ad-CMVp-CDglyTK治療系統(tǒng)與Ad-CMVp-TK治療系統(tǒng)、Ad-CMVp-CD治療系統(tǒng)間的細(xì)胞克隆形成率差異顯著，Ad-VEGFp-CDglyTK治療系統(tǒng)和Ad-CMVp-CDglyTK治療系統(tǒng)的細(xì)

6、胞克隆形成率明顯減低。 細(xì)胞存活率：用Ad-VEGFp-CDglyTK、Ad-CMVp-CDglyTK、Ad-CMVp-TK、Ad-CMVp-CD治療的細(xì)胞存活率分別為18.22％、18.22％、46.22％、49.78％，Ad-VEGFp-CDglyTK治療系統(tǒng)、Ad-CMVp-CDglyTK治療系統(tǒng)與Ad-CMVp-TK治療系統(tǒng)、Ad-CMVp-CD治療系統(tǒng)治療后的細(xì)胞存活率差異顯著，Ad-VEGFp-CDglyTK治療系統(tǒng)

7、和Ad-CMVp-CDglyTK治療的細(xì)胞存活率明顯減低；各重組腺病毒本身或5-FC、GCV對(duì)Lovo細(xì)胞未見(jiàn)有毒性作用；用5-FC、GCV治療轉(zhuǎn)染有重組腺病毒的Lovo細(xì)胞的殺傷效應(yīng)明顯；CD基因和TK基因?qū)ovo細(xì)胞有協(xié)同殺傷效應(yīng)，雙基因基因殺傷作用比單一自殺基因強(qiáng)。 體外旁觀者效應(yīng)：各重組腺病毒作用后的Lovo細(xì)胞的存活率并不與轉(zhuǎn)染重組腺病毒的細(xì)胞混合比例成直線線性變化的，而是成曲線變化。兩種單自殺基因組的轉(zhuǎn)基因Lovo

8、細(xì)胞占50％時(shí)，有約10％細(xì)胞存活；而兩種雙自殺基因組的轉(zhuǎn)基因Lovo細(xì)胞占30％時(shí)，就有約10％細(xì)胞存活；CMV與VEGF啟動(dòng)子分別驅(qū)動(dòng)的雙自殺基因組的體外旁觀者效應(yīng)相仿。 動(dòng)物模移植瘤治療后的重量及抑瘤率：Ad-VEGFp-CDglyTK組為(54.21±7.35)mg，抑瘤率為89.18％；Ad-CMVp-CDglyTK組為(94.50±7.05)mg、抑瘤率為81.14％；Ad-CMVp-TK組為(206.71±9.82

9、)mg、抑瘤率為58.74％；Ad-CMVp-CD組為(185.61±9.30)mg、抑瘤率為62.95％；各組瘤重和抑瘤率明顯不同，Ad-VEGFp-CDglyTK組瘤重最輕、抑瘤率最高。 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化觀察：體外實(shí)驗(yàn)后，Ad-VEGFp-CDglyTK治療的LOVO細(xì)胞被殺傷，可見(jiàn)細(xì)胞明顯凋亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)后，常規(guī)病理下見(jiàn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制，特別是Ad-VEGFp-CDglyTK抑瘤作用最明顯；電鏡下轉(zhuǎn)染重組腺病毒的各組可均見(jiàn)腫

10、瘤細(xì)胞凋亡，而未轉(zhuǎn)染重組腺病毒組則未見(jiàn)變化。治療組的裸鼠肝、腎、肺和心臟組織未見(jiàn)明顯的病理變化。 實(shí)驗(yàn)研究結(jié)論：1VEGF啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的雙自殺基因治療系統(tǒng)對(duì)大腸癌LOVO細(xì)胞具有明顯的體外殺傷作用，其殺傷作用強(qiáng)于單自殺基因。 2VEGF啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的雙自殺基因治療系統(tǒng)對(duì)大腸癌有明顯的體內(nèi)抑瘤作用，比單自殺基因治療系統(tǒng)及CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的雙自殺基因治療系統(tǒng)抑瘤作用更明顯。 3VEGF啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的雙自殺基因重組腺病毒在動(dòng)