靶向hTERT的特異性siRNA抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖機(jī)制研究.pdf

1、肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，惡性程度高，轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，近20年來(lái)其死亡率增加了41.8％，嚴(yán)重影響人們的身心健康甚至危及生命。目前運(yùn)用手術(shù)、放療、化療以及免疫等方法來(lái)治療肝癌，患者的生存率有明顯提高，但是這些治療方法選擇性低，靶向性差。因此，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，基因靶向治療肝癌的研究越來(lái)越受到關(guān)注。
　　 人端粒酶是一種核蛋白復(fù)合物，具有維持和延長(zhǎng)真核細(xì)胞染色體末端端粒結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖潛能和壽命的功能。端粒酶有三個(gè)主要組

2、成部分：RNA亞基(hTR)，端粒酶相關(guān)蛋白1(hTP1)，具有催化活性的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)。近年來(lái)研究表明端粒酶在85％-95％的惡性腫瘤細(xì)胞中有表達(dá)，而在正常細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，這說(shuō)明端粒酶是細(xì)胞永生化和癌變的關(guān)鍵步驟，因此抑制端粒酶的活性是惡性腫瘤基因治療的理想靶點(diǎn)。另外，由于端粒酶的活性是通過(guò)激活hTERT而實(shí)現(xiàn)的，端粒酶的活性與hTERT的表達(dá)密切相關(guān)，hTERT是端粒酶中最重要的成分，在細(xì)胞癌變中起限速作用，因此hT

3、ERT成為最具有吸引力的腫瘤治療的靶標(biāo)。
　　 以端粒酶為靶點(diǎn)的腫瘤基因治療研究中，主要采用RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)沉默hTERT基因，RNAi是生物進(jìn)化過(guò)程中遺留下來(lái)的一種轉(zhuǎn)錄后通過(guò)RNA調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制。它通過(guò)小干擾RNA(smallinterferring RNA，siRNA)特異性地結(jié)合并降解靶向mRNA而起作用，siRNA是一種極具前景的基因靶向藥物。本研究依據(jù)RNAi原理，以hTE

4、RT基因?yàn)榘悬c(diǎn)，用hTERT高表達(dá)的肝癌SMMC-7721細(xì)胞為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)靶向hTERT基因的小干擾RNA，通過(guò)體外轉(zhuǎn)染肝癌SMMC-7721細(xì)胞，篩選出其有效序列，并觀察其對(duì)細(xì)胞抑制生長(zhǎng)效果，hTERT mRNA與蛋白表達(dá)情況及細(xì)胞凋亡情況，進(jìn)一步探討其機(jī)制，為肝癌的治療探索一條新的途徑。本研究?jī)?nèi)容如下：
　　 第一部分：靶向hTERT siRNA有效序列的篩選根據(jù)GenBank中hTERT mRNA序列(AF015950

5、)和siRNA設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)了6條21堿基的siRNA，化學(xué)合成法合成出雙鏈siRNA，以Lipofectamin TM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染肝癌SMMC-7721細(xì)胞。分別采用SRB(磺酰羅丹明B)法，RT-PCR法評(píng)價(jià)其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)，hTERT mRNA表達(dá)的抑制作用。結(jié)果表明siRNA-2和siRNA-6能抑制SMMC-7721細(xì)胞的增殖及顯著沉默hTERT基因，而其他四條無(wú)明顯作用。
　　 第二部分：RNA干擾抑制hTERT表達(dá)

6、誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡在第一部分中，通過(guò)篩選，得到2條能高效抑制hTERT基因表達(dá)的siRNA：siRNA-2和siRNA-6。為了深入研究其機(jī)制，在此部分，這2條siRNA轉(zhuǎn)染肝癌SMMC-7721細(xì)胞后，以PI單染法，檢測(cè)它們對(duì)細(xì)胞周期的影響；以AnnexinV-FITC/PI雙染法，檢測(cè)它們對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用；并以Western blot檢測(cè)hTERT蛋白水平的變化及凋亡通路中Bcl-2，Bax，cyclin B1的表達(dá)

7、水平，探討凋亡產(chǎn)生的機(jī)制。結(jié)果表明有效序列siRNA能下調(diào)hTERT的表達(dá)，能迅速誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡，其機(jī)制主要是通過(guò)內(nèi)源性凋亡途徑中線粒體通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。
　　 結(jié)論：
　　 1.以hTERT基因?yàn)榘悬c(diǎn)，設(shè)計(jì)合成了6條siRNA序列，從中成功篩選出兩條有效序列siRNA，分別是hTERT-siRNA-2和hTERT-siRNA-6。
　　 2.siRNA-2和siRNA-6轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能降低hTERT m