特異性siRNA抑制人肺癌細胞95D中hTERT基因表達及細胞生長的實驗研究.pdf

1、研究背景與目的： 肺癌是當今世界最常見的惡性腫瘤之一，在所有癌癥的發(fā)病率和死亡率中，肺癌始終位于前列。在我國肺癌分別位居男、女性惡性腫瘤發(fā)病率的首位和第二位，而男女惡性腫瘤死亡率最高的均為肺癌。肺癌對人類的健康已經(jīng)構(gòu)成了嚴重的威脅。因此人們在重視手術(shù)治療、放療、化療等傳統(tǒng)治療手段的同時，也在積極探尋新的療法。 腫瘤基因治療近年來作為癌癥治療研究的新熱點得到不斷發(fā)展。其中RNA干擾（RNA interference，RNA

2、i）是一種從低等植物到高等哺乳動物普遍存在的生物學(xué)現(xiàn)象，是由小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）引導(dǎo)的靶mRNA降解的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。通過RNA干擾對關(guān)鍵基因的沉默作用，可以抑制致病核酸的表達或者異常蛋白的合成。與其他基因治療手段相比，RNA干擾技術(shù)顯示出高效性、特異性、便捷性等優(yōu)越之處，正在引領(lǐng)基因治療的新潮流，具有可觀的應(yīng)用前景。 基因治療需要有效的靶位點，因此篩選有效的基因治療靶點十分重

3、要。已知端粒酶活性幾乎在絕大多數(shù)人類惡性腫瘤中都可以檢測到，而在幾乎所有的成人體細胞中呈現(xiàn)陰性，因此與惡性腫瘤之間有很高的相關(guān)性。端粒酶的高活性在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中有亦有著重要作用，其催化亞基端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）是端粒酶活性和腫瘤發(fā)展中的決定性因子，因而有望成為肺癌基因治療的理想靶點。 本研究利用實時熒光定量PCR技術(shù)對肺癌細胞中的hTERT

4、mRNA表達進行定量分析，篩選出相對表達量最高的肺癌細胞株95D。將化學(xué)合成的siRNA轉(zhuǎn)染入95D細胞中，探討針對hTERT的特異性siRNA介導(dǎo)的RNA干擾對肺癌細胞中hTERT基因表達的沉默及對肺癌細胞增殖的抑制作用。 研究內(nèi)容和方法： 1．優(yōu)化PCR條件，通過Real Time RT-PCR技術(shù)檢測人肺癌細胞系L78、NCI-H520、A549、LTEP-α-2、NCI-H460和95D中hTERT mRNA的相

5、對表達量。 2．根據(jù)hTERT基因序列和siRNA設(shè)計原則，設(shè)計并化學(xué)合成三對siRNA，將siRNA轉(zhuǎn)染入hTERT mRNA高表達的肺巨細胞癌細胞95D中，應(yīng)用Real Time RT-PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后hTERT mRNA表達水平變化情況。 3．流式細胞術(shù)檢測hTERT siRNA轉(zhuǎn)染后所介導(dǎo)的RNA干擾作用對于肺癌細胞凋亡水平的誘導(dǎo)和影響。 4．MTT法檢測hTERT siRNA對于肺癌細胞生長、增殖能

6、力的抑制作用。 結(jié)果： 1．目的基因和內(nèi)參照基因的PCR產(chǎn)物片段大小均與預(yù)計值一致，說明各細胞中RNA提取及RT-PCR過程均良好。Real Time RT-PCR結(jié)果表明hTERT mRNA在多個肺癌細胞系中均高表達，其中在肺巨細胞癌95D中相對表達量最高。以95D為實驗對象進行RNA干擾研究。 2．hTERT siRNA轉(zhuǎn)染95D細胞48小時后（轉(zhuǎn)染濃度為100nmol/L），與空白脂質(zhì)體對照組和陰性對照組比

7、較，siRNA-1和siRNA-2均明顯抑制了hTERTmRNA表達（P值均小于0．01），抑制率分別為77．33±5．13%和50．67±8．02%，siRNA-3抑制率較低，僅為27．67±10．26%。 3．選取抑制效果最顯著的hTERT siRNA-1對95D肺癌細胞進行由低到高3個濃度的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染濃度分別為50nmol/L，80nmol/L，100nmol/L。50nmol/L濃度轉(zhuǎn)染組與陰性對照組之間hTERT mR

8、NA表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0．05）。80nmol/L組、100nmol/L濃度轉(zhuǎn)染組分別與陰性對照組比較，hTERT mRNA表達量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均小于0．01），而這兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0．05）。 4．轉(zhuǎn)染48h后，與空白脂質(zhì)體對照組比較，50nmol/L、80mol/L、100nmol/L濃度的hTERT siRNA-1轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率均顯著增加（P值均小于0．01）。與陰性對照組比較，50nm

9、ol/L濃度轉(zhuǎn)染組的細胞凋亡率無顯著增加（P>0．05），而80nmol/L、100nmol/L組細胞凋亡率顯著增加（P值均小于0．01）?？瞻字|(zhì)體對照組與陰性對照組比較亦有顯著差異（P<0．05）。 5．MTT檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染12小時后肺癌細胞增殖抑制作用開始顯現(xiàn)，但效果尚弱，24小時已較明顯，48小時最顯著，72小時抑制效果轉(zhuǎn)弱。hTERTsiRNA可以有效抑制肺癌細胞增殖，抑制效應(yīng)具有時間依賴性。 結(jié)論：