2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  肝臟是調(diào)節(jié)機體內(nèi)多種生理反應,例如糖原貯存、脂肪代謝、蛋白分泌和藥物代謝等的重要器官。而肝實質(zhì)細胞作為肝臟最主要的細胞類型,對于維持肝臟代謝、解毒和穩(wěn)態(tài)等功能起著不可或缺的作用。因此,肝細胞是研究肝臟代謝、肝疾病發(fā)病機制、肝移植和藥物篩選等重要的細胞模型。隨著嚙齒類動物肝細胞系的建立和應用,篩選出很多新型的肝病治療藥物,但是因為遺傳背景的差異,藥物治療在實際應用中達不到預期效果。因此更能代表人類遺傳背景的靈長類動物越來

2、越多地被應用于基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學研究。普通狨猴( common marmoset),作為新大陸猴,因為體型小、繁殖率高、生理特性與人類類似等特點,已經(jīng)被成功應用于帕金森綜合癥等神經(jīng)退化性疾病模型。另外,狨猴對肝臟疾病比較敏感,已經(jīng)被成功地用做GBVB-HCV嵌合病毒猴模型,但是目前還沒有可以成功感染嵌合病毒的肝細胞模型,因此狨猴肝細胞系的建立對于肝病及其他疾病的研究和臨床轉(zhuǎn)化意義重大。本研究致力于建立具有增殖能力和代謝及體內(nèi)再生能力的狨猴肝

3、細胞系,以期為人類肝臟疾病的發(fā)病機理,藥物篩選及治療等提供良好的靈長類肝細胞模型。
  方法:
  1.狨猴原代肝細胞的分離與傳代培養(yǎng):利用膠原酶IV消化2周大流產(chǎn)狨猴肝組織,離心,鋪于6孔板。利用威廉姆斯E培養(yǎng)基,同時添加20ng/ml肝細胞生長因子、20ng/ml表皮細胞生長因子、1×胰島素鐵硒傳遞蛋白、10%10099血清、10μM地塞米松、10%青/鏈霉素、10%L-谷氨酰胺、75mg牛血清白蛋白、10ng/ml煙酰

4、胺。
  2.狨猴肝細胞系建系方法的優(yōu)化:利用慢病毒包裝體系psPAX2和pMD2.G分別包裝猴病毒大 T抗原和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶質(zhì)粒,并且轉(zhuǎn)染原代狨猴肝細胞。通過綠色熒光蛋白和嘌呤霉素抗性篩選,以獲得成功感染的陽性細胞克隆。
  3.狨猴肝細胞系的建立和驗證:通過檢測猴病毒大T抗原轉(zhuǎn)染的原代肝細胞,連續(xù)的傳代次數(shù)、增殖能力和形態(tài)學,以證明狨猴肝細胞系的建立。
  4.狨猴肝細胞系染色體穩(wěn)定性及成瘤性檢測:通過細胞核型的

5、提取、DAPI染色、染色體數(shù)目的統(tǒng)計和分型,以證明狨猴肝細胞系在建系過程中是否存在染色體的丟失與重組;通過裸鼠皮下成瘤試驗,以證明狨猴肝細胞系是否在建系過程中發(fā)生癌化。
  5.狨猴肝細胞系相關(guān)基因表達譜分析:通過半定量RT-PCR和共聚焦顯微鏡檢測,分別從基因和蛋白水平的表達,以驗證狨猴肝細胞系在肝臟特異基因的表達情況。
  6.狨猴肝細胞系超微結(jié)構(gòu)分析和基本生理功能的驗證:通過電鏡對狨猴肝細胞系的超微結(jié)構(gòu),包括線粒體、肝

6、糖原和微絨毛等進行觀察分析;通過糖原貯存、脂滴形成和吲哚菁綠(ICG)代謝試驗,以證明狨猴肝細胞的體外代謝能力。
  7.狨猴肝細胞系的藥物一級代謝和排出功能測試:通過半定量RT-PCR,對肝細胞一級代謝相關(guān)基因CYP家族中CYP3A4、CYP1A1、CYP1A2等,進行基底水平表達分析和藥物(利福平、3-甲基膽蒽)刺激后相應基因的表達定量分析,以驗證狨猴肝細胞系藥物一級代謝能力;通過綠色熒光標記CDFDA的攝入定位試驗,以證明狨

7、猴肝細胞系是否具有膽管排出能力。
  8.狨猴肝細胞系在FAH缺陷小鼠上的功能驗證:延胡索酰乙酰乙酸水解酶缺陷型小鼠模型(FAH-/-)是一種肝臟代謝疾病小鼠模型,將1x107狨猴肝細胞,通過脾臟移植到FAH-/-小鼠肝臟中。利用FAH和GFP免疫組化染色,以檢測細胞移植后小鼠肝功能改善、體重和生存期變化等,與未移植細胞組小鼠比較,以證明狨猴肝細胞系在體內(nèi)的修復再生能力。
  9.狨猴肝細胞系干性相關(guān)特性的研究:通過檢測肝干

8、細胞相關(guān)基因的表達和3D培養(yǎng)誘導膽管分化試驗,以證明狨猴肝細胞系是否具有肝干細胞的特性。
  10.狨猴肝細胞其他方面研究:利用CRISPR-Cas9技術(shù),敲除狨猴原代肝細胞中抑癌基因TP53,以確定其對狨猴肝細胞增殖能力和成瘤性的影響。通過裸鼠成瘤試驗,以證明TP53基因敲除對狨猴肝細胞癌化的影響。
  結(jié)果:
  1.成功分離和獲取具有肝細胞上皮形態(tài)和增殖能力有限的狨猴原代肝細胞。
  2.建系方法優(yōu)化試驗,

9、確定猴病毒大T抗原慢病毒過表達的方法,建立狨猴肝細胞系效果更佳。
  3.通過篩選獲取6個陽性細胞克隆,其中MHCL-1和MHCL-2細胞克隆可以穩(wěn)定傳代,并且連續(xù)培養(yǎng)超過100代以上,確認其無限增殖能力。同時,共聚焦顯微鏡分析,發(fā)現(xiàn):E-cadherin表達降低和 a-SMA表達升高,說明肝細胞系有上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(EMT)發(fā)生,但在傳代過程中形態(tài)無明顯變化。
  4.狨猴肝細胞系染色體染色結(jié)果顯示:肝細胞系為正常狨猴染

10、色體條數(shù)46條,未發(fā)現(xiàn)染色體缺失、重組;通過吉姆薩G帶染色,將46條染色體分為23對;而裸鼠成瘤性試驗結(jié)果表明:所獲得狨猴肝細胞系不具有成瘤性。
  5.通過半定量RT-PCR和共聚焦顯微鏡檢測,對狨猴肝細胞系基因表達譜分析結(jié)果顯示:兩個狨猴肝細胞克隆,都表達大部分肝特異性基因,包括 ALB、AAT和HNF4A等,但是上皮細胞特異性基因表達減弱,包括CK19、CK7和CK18,證明狨猴肝細胞系雖然形態(tài)發(fā)生變化,但其肝細胞功能相關(guān)基

11、因表達基本正常。
  6.通過吲哚菁綠(ICG)的攝入和排出、肝糖原染色和油紅染色等體外功能試驗,證明狨猴肝細胞系具有肝細胞基本特性和生理功能。
  7.通過檢測利福平和3-甲基膽蔥誘導前后,狨猴肝細胞系藥物一級代謝相關(guān)CYP家族中CYP3A4、1A1和1A2基因的表達水平,證明狨猴肝細胞系表達本底水平CYP,并且在藥物刺激下CYP表達增加。這些結(jié)果表明該狨猴肝細胞系具有藥物一級代謝相關(guān)活性。
  8.通過 FAH-/

12、-小鼠體內(nèi)移植狨猴肝細胞系試驗,結(jié)果表明:與對照組相比,狨猴肝細胞系可以顯著改善5只移植小鼠肝功能、延長其生存期和恢復其體重。FAH和GFP的免疫組化染色,也證明了狨猴肝細胞系具有體內(nèi)整合和再生能力。
  9.在狨猴肝細胞干性試驗中,通過半定量RT-PCR和共聚焦試驗,證明狨猴肝細胞系表達肝干細胞相關(guān)基因,包括AFP和SOX9。同時,利用Matrigel和Collagen為基質(zhì)的3D培養(yǎng),結(jié)果顯示:狨猴肝細胞系可以在體外分化為類似

13、膽管的結(jié)構(gòu),提示狨猴肝細胞系具有肝干細胞的特性。
  10.在利用 Crispr-Cas9在原代肝細胞敲除試驗中,通過基因組測序和 Western,證明獲得TP53-KO狨猴原代肝細胞模型;在裸鼠皮下成瘤試驗中,通過病理染色確認類似畸胎瘤的出現(xiàn),提示TP53的敲除可能會影響狨猴原代肝細胞的分化能力。
  結(jié)論:
  1、獲得了可穩(wěn)定傳代、表達肝特異性基因和染色體正常的狨猴肝細胞系MHCL-1和MHCL-2,且這些肝細胞

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