LSECtin-CRD在大腸桿菌中載體構(gòu)建及重組蛋白的表達(dá).pdf

1、 目的：為了獲得足量可溶的重組蛋白C型凝集素(liver and lymph node sinusoidal endothelial cell C-type lectin, LSECtin)糖基識(shí)別結(jié)構(gòu)域(carbohydrate-recognition domains,CRDs),便于進(jìn)一步用位置定向自旋標(biāo)記-電子順磁共振方法(SDSL-EPR)研究生理狀態(tài)下蛋白行使功能時(shí)構(gòu)象及運(yùn)動(dòng)性改變的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)信息,進(jìn)行了一系列的原核重組蛋白表

2、達(dá)實(shí)驗(yàn)的研究。方法：(1)重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：擬構(gòu)建三個(gè)不同載體, [PET-22b(+)-LSECtin-CRD、PGEX-6p-LSECtin-CRD和PGEX-6p-LSECtin]。按實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶ν庠碊NA片段(LSECtin和LSECtin-CRD)進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)與合成,PCR擴(kuò)增,瓊脂糖鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,鑒定正確后膠回收,雙酶切鑒定正確的PCR片段,再次膠回收,獲得純化的外源DNA小片段；提取質(zhì)粒[PET-22b(+)和PG

3、EX-6p-1],對質(zhì)粒載體按實(shí)驗(yàn)要求雙酶切后,膠回收,獲得純化的質(zhì)粒DNA大片段。對質(zhì)粒DNA[PET-22b(+)和PGEX-6p-1]以及外源DNA(LSECtin和LSECtin-CRD)進(jìn)行濃度測定。連接外源DNA小片段和質(zhì)粒載體 DNA 大片段。將成功連接的三個(gè)不同表達(dá)載體[PET-22b(+)-LSECtin-CRD、PGEX-6p-LSECtin-CRD 和 PGEX-6p-LSECtin]轉(zhuǎn)化DH-5α感受態(tài)細(xì)胞,擴(kuò)大

4、培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,酶切鑒定正確后挑克隆搖菌送invitrogen公司測序。(2)重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)：將成功構(gòu)建好的三個(gè)不同的 表 達(dá) 載 體 [PET-22b(+)-LSECtin-CRD 、 PGEX-6p-LSECtin-CRD 和PGEX-6p-LSECtin]轉(zhuǎn)化至兩個(gè)不同的宿主菌[BL21(DE3)和Origami(DE3)],挑單克隆,擴(kuò)大培養(yǎng),酶切鑒定正確,挑克隆進(jìn)行重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)并進(jìn)行SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)情況,以及

5、進(jìn)一步用Western blot鑒定重組蛋白的表達(dá)。(3)重組蛋白的純化復(fù)性：經(jīng)優(yōu)化比較,挑取表達(dá)良好的融合蛋白[Origami(DE3)-PGEX-6p-1-LSECtin-CRD]進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá),收集菌體,純化復(fù)性,SDS-PAGE 檢測蛋白的純度,保存蛋白。結(jié)果：成功構(gòu)建三種不同的表達(dá)載體[PET-22b(+)-LSECtin-CRD, PGEX-6p-LSECtin-CRD,PGEX-6p-LSECtin],在兩種不同的宿主菌

6、[BL21(DE3)和Origami(DE3)]中均成功表達(dá)大量重組蛋白,均以包涵體的形式存在。選取表達(dá)良好的融合蛋白[Origami ( DE3 ) PGEX-6p-LSECtin-CRD]進(jìn)行純化和復(fù)性,獲得了足量可溶蛋白( PGEX-6P-1-LSECtin-CRD )。結(jié)論：成功構(gòu)建三種不同表達(dá)載體[PET-22b(+)-LSECtin-CRD, PGEX-6p-LSECtin-CRD,PGEX-6p-LSECtin],并在兩種