間歇性低壓缺氧預處理抗大鼠全腦缺血-再灌注損傷及其機制初探.pdf

1、目的:1986年,Murry等人發(fā)現(xiàn),給心臟一次或多次短暫缺血后,可誘導心臟抵抗較嚴重缺血引起的損傷,稱之為缺血預處理,從此拉開了預處理研究的序幕。1990年,Kitagawa等的研究發(fā)現(xiàn),短暫腦缺血可增強海馬神經(jīng)元對以后嚴重缺血的耐受能力,提示對缺血極為敏感的海馬神經(jīng)元也具有這一內(nèi)源性保護機制。此后,有研究者證實,低氧預處理(HypoxicPreconditioning,HP)對成年大鼠也具有腦保護作用,能夠使腦組織抵抗較嚴重缺血所致

2、的損傷,之后,又有遠端器官缺血預處理等研究報道,這些研究使得預處理的方式不斷豐富,也為人們探索預處理抗組織缺血的機制開拓了思路。
　　 有關低氧預處理抗腦缺血以及腦缺血/再灌注(Ischemia Reperfusioninjury,I/R)損傷作用的研究已有一些報道,但低氧預處理的方法各異,目前尚缺乏公認理想的預處理模型,有關低壓缺氧預處理的方式和作用的報道較少,更缺乏有關其作用機制的研究。
　　 本實驗根據(jù)預處理的一般

3、知識,結合低氧預處理方面的有限資料,改良呂國蔚急性重復缺氖預處理動物模型,建立間歇性低壓缺氧預處理(Intermittent Hypobaric Hypoxia Preconditioning,IHHP)動物模型。采用四血管阻斷法致大鼠全腦缺血,觀察間歇性低壓缺氧預處理對大鼠全腦缺血8min后再灌注海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷的影響,并初步探討其保護作用的機制。
　　 1間歇性低壓缺氧預處理對大鼠全腦缺血/再灌注后海馬CA1區(qū)形態(tài)學改

4、變和海馬神經(jīng)元凋亡的影響
　　 方法:72只健康雄性Wistar大鼠,體重280～300g,隨機分為6組。每組12只動物。分別為:①假手術組(Sham),只凝閉雙側椎動脈,48h后暴露雙側頸總動脈但不夾閉。②間歇性低壓缺氧預處理組(IHHP),于凝閉雙側椎動脈前6d開始,暴露于低壓(大氣壓為70.66-70.93kp)缺氧環(huán)境,每日一次,共6次,第7天凝閉雙側椎動脈,48h后暴露雙側頸總動脈但不夾閉。③缺血/再灌注組(I/R),

5、凝閉雙側椎動脈,48h后暴露雙側頸總動脈并夾閉8min,而后恢復血流再灌注。④間歇性低壓缺氧預處理2次+全腦缺血/再灌注組(IHH2+I/R),低壓缺氧預處理2天,每天一次,第3天凝閉雙側椎動脈,48h后暴露雙側頸總動脈并夾閉8min,而后恢復血流再灌注。⑤間歇性低壓缺氧預處理4次+全腦缺血/再灌注組(IHHP4+I/R),低壓缺氧預處理4天,每天一次,第5天凝閉雙側椎動脈,48h后暴露雙側頸總動脈并夾閉8min,而后恢復血流再灌注。⑥

6、間歇性低壓缺氧預處理6次+全腦缺血/再灌注組(IHHP6+I/R),低壓缺氧預處理6天,每天一次,第7天凝閉雙側椎動脈,48h后暴露雙側頸總動脈并夾閉8min,而后恢復血流再灌注。12只動物中,6只于再灌注后7天處死取海馬,用于硫堇染色觀察海馬CA1區(qū)組織學分級和存活神經(jīng)元數(shù)目;另外6只于再灌注后3天處死取海馬,采用流式細胞技術檢測海馬神經(jīng)元凋亡率。
　　 組織學分級方法:參照Kato分級方法,在光學顯微鏡下對海馬CA1區(qū)組織學

7、改變進行分級(Histological grade,HG)。0級,無神經(jīng)元死亡;1級,有散在的神經(jīng)元死亡;2級,成片神經(jīng)元死亡;3級,幾乎全部的神經(jīng)元死亡。取雙側海馬平均等級作為統(tǒng)計值。
　　 計數(shù)存活神經(jīng)元密度值:于高倍光學顯微鏡下計數(shù)海馬CA1區(qū)每1mm區(qū)段內(nèi)細胞膜完整、胞核飽滿、核仁清晰的錐體細胞數(shù)目,每張切片雙側海馬各計數(shù)3個區(qū)段,取平均值作為每一例的存活神經(jīng)元密度值(Neuronaldensity,ND)。
　　

8、 結果:
　　 1.1間歇性低壓缺氧預處理對大鼠全腦缺血/再灌注后海馬CA1區(qū)組織學分級及存活神經(jīng)元密度的影響
　　 Sham組錐體細胞排列整齊,幾乎無錐體細胞缺失現(xiàn)象,細胞膜完整,細胞核及核仁完整清晰,組織學分級為0級～1級。存活神經(jīng)元密度值較高,為149.27±13.58(cells/mm,下同)。IHHP組大鼠海馬CA1區(qū)組織形態(tài)與Sham組比較變化不明顯,組織學分級無明顯改變(P＞0.05),神經(jīng)元密度值為13

9、5.57±14.60,與Sham組相比無顯著性差異(P＞0.05),但出現(xiàn)個別錐體細胞水腫及細胞間隙增寬的現(xiàn)象。I/R組大鼠海馬CA1區(qū)組織明顯損傷,核膜完整、核仁清楚的錐體細胞稀疏,排列紊亂,錐體細胞明顯缺失,存留細胞中部分細胞胞體形態(tài)不規(guī)則,呈多角型或梭型,胞膜皺縮,胞核固縮濃染,HG為2～3級,ND為20.53±5.16,與Sham組相比,HG明顯升高,ND明顯減少(P＜0.01)。IHHP+I/R各組海馬CA1區(qū)錐體細胞排列情況

10、和細胞形態(tài)均較I/R.組明顯改善,組織學分級降低(P＜0.01),其中IHHP4+I/R和IHHP6+I/R組較IHHP2+I/R組組織學分級改善更加明顯(P＜0.01),與I/R組相比,IHHP2+I/R、IHHP4+I/R和IHHP6+I/R組存活神經(jīng)元密度值均明顯增加(P＜0.01),分別為44.92±7.61、75.12±7.66和87.47±11.07,其中IHHP4+I/R和IHHP6+I/R組較IHHP2+I/R神經(jīng)元密度

11、值增加更明顯(P＜0.01),但IHHP4+I/R和IHHP6+I/R組比較無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 1.2間歇性低壓缺氧預處理對大鼠全腦缺血/再灌注后海馬神經(jīng)元凋亡率的影響
　　 Sham組與IHHP組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率均較低,分別為2.68±0.49％和3.04±0.72％,IHHP組雖較Sham組有所升高,但二者相比無顯著性差異(P＞0.05)。與Sham組比較,I/R組海馬神經(jīng)元凋亡率顯著增高(P＜

12、0.01),為14.78±2.74％。IHHP+I/R各組海馬神經(jīng)元凋亡率均較I/R組顯著降低(P＜0.01),IHHP2+I/R.、IHHP4+I/R和IHHP6+I/R組分別為11.77±1.86％、7.09±1.6％和9.49±1.2％,其中IHHP4+I/R和IHHP6+I/R組與IHHP2+I/R組比較,海馬神經(jīng)元凋亡率進一步降低(P＜0.01),IHHP6+I/R組與IHHP4+I/R組比較,海馬神經(jīng)元凋亡率沒有進一步降低反

13、而有所升高,提示預處理次數(shù)過多有可能誘導神經(jīng)元凋亡。
　　 2間歇性低壓缺氧預處理對大鼠全腦缺血/再灌注后海馬CA1區(qū)Ngb和Bcl-2蛋白表達的影響
　　 方法:24只健康雄性Wistar大鼠,體重280～300g,隨機分為4組。①假手術組(Sham),只凝閉雙側椎動脈,48h后暴露雙側頸總動脈但不夾閉。②間歇性低壓缺氧預處理組(IHHP),于凝閉雙側椎動脈前4d開始,暴露于低壓(大氣壓為70.66-70.93kp)缺

14、氧環(huán)境,每日一次,共4次,第5天凝閉雙側椎動脈,48h后暴露雙側頸總動脈但不夾閉。⑨缺血/再灌注組(I/R),凝閉雙側椎動脈,48h后暴露并夾閉頸總動脈8min后恢復血液再灌流。④間歇性低壓缺氧預處理+全腦缺血/再灌注組(IHHP+I/R),低壓缺氧4天,每天一次,第5天凝閉雙側椎動脈,48h后暴露雙側頸總動脈并夾閉8min,而后恢復再灌注。各組動物均于再灌注后24h取材,采用免疫組織化學方法觀察海馬CA1區(qū)腦紅蛋白(neuroglob

15、in,Ngb)及B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia2,Bcl-2)蛋白的表達。
　　 結論:
　　 ①單純間歇性低壓缺氧預處理對大鼠海馬神經(jīng)元無明顯影響,但可減輕大鼠全腦缺血/再灌注引起的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷程度,抑制神經(jīng)元凋亡,對全腦缺血/再灌注后大鼠海馬組織具有明顯的保護作用。
　　 ②適當?shù)念A處理次數(shù)是誘導有效腦保護作用的必要條件。
　　 ③間歇性低壓缺氧預