TIMP-2、MT1-MMP、MMP-2的表達對人類單核細胞白血病細胞系SHI-1細胞侵襲力影響的研究.pdf

1、目的和意義：
　　 急性白血病常伴有髓外浸潤(EMI)的發(fā)生，急性髓細胞白血病(AML)中EMI的發(fā)生率約為20％-40％，并且多見于FAB分型中的M4、M5亞型。伴有EMI的患者大多數(shù)誘導(dǎo)化療后的緩解率低，總體生存時間短，預(yù)后差。闡明白血病髓外浸潤的病理發(fā)生過程及機制，有助于預(yù)防白血病的復(fù)發(fā)，改善白血病的預(yù)后。研究表明AML的EMI如同腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移一樣，需要白血病細胞克服ECM屏障。已有研究報道急性白血病患者高表達基質(zhì)金屬

2、蛋白酶(MMPs)，并且提示這些高表達可能與EMI的特性有關(guān)，但是MMPs及其抑制劑在AML的EMI中確切作用和機制仍不清楚。SHI-1細胞是本研究所建立的一株具有高浸潤特性的人類急性單核細胞白血病細胞系。本實驗室前期研究中已用SHI-1細胞在裸鼠體內(nèi)建立了白血病多臟器浸潤的動物模型，并報道上調(diào)組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑2(TIMP-2)促進了SHI-1細胞在裸鼠體內(nèi)的浸潤。在此基礎(chǔ)上，本課題將研究TIMP-2、I型膜型基質(zhì)金屬蛋白酶(

3、MTl-MMP)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)的表達對SHI-1細胞體內(nèi)外侵襲力的影響，探索白血病髓外浸潤的機制。
　　 方法：
　　 第一部分體外培養(yǎng)SHI-1、NB4、K562、U937、THP-1細胞和骨髓基質(zhì)細胞(BMSCs)。定量PCR檢測五株細胞的TIMP-2、MTl-MMP、MMP-2的mRNA表達水平，Western blot檢測蛋白表達水平。RNA干擾分別沉默SHI-1細胞的TIMP-2、MTl-MM

4、P、MMP-2。構(gòu)建TIMP-2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，轉(zhuǎn)染SHI-1細胞，G418篩選出多克隆細胞，RT-PCR鑒定有外源性TIMP-2基因整合后，經(jīng)有限稀釋法挑選出單克隆細胞S1、S2、S3。PCR鑒定單克隆細胞的外源性TIMP-2基因整合。定量RT-PCR檢測單克隆細胞TIMP02、MTl-MMP、MMP-2的mRNA表達水平，Western blot檢測蛋白表達水平。明膠酶譜法測定五種細胞株、單克隆細胞、干擾后的細胞單獨培養(yǎng)或和BMSC

5、s共培養(yǎng)24小時后上清中MMP-2酶原(proMMP-2)分泌和活化的MMP-2的表達。收集BMSCs單獨無血清培養(yǎng)24h、48h、72h后的上清檢測proMMP-2的分泌和活化的MMP-2?？缒で忠u實驗觀察各種細胞單獨培養(yǎng)或和BMSC共培養(yǎng)24小時后侵襲人工基質(zhì)膜的能力。
　　 第二部分對4周齡的BALB/c裸鼠進行脾臟切除(splenectomy)、環(huán)磷酰胺腹腔注射(cytoxan intraperitoneal injec

6、tion)及全身亞致死劑量輻照(sublethal irradiation)等預(yù)處理(SCI預(yù)處理)后隨機分為：空白對照組(n=5)、實驗組(SHI-1組、MOCK組、S1組、S2組、S3組，每組n=15)。經(jīng)尾靜脈接種lxl0?含不同細胞的IMDM液0.2ml/只后，在層流柜中無菌飼養(yǎng)觀察至注射后60天。于裸鼠瀕死前或死亡后即行解剖，留取骨髓涂片，瑞氏染色觀察有無異常的白血病細胞；各臟器常規(guī)病理切片，觀察異常白血病細胞在各臟器中的浸潤

7、情況；RT-PCR檢測裸鼠各臟器中人白血病細胞MLL/AF6融合基因的表達。流式細胞儀(FCM)檢測裸鼠股骨骨髓中人CD45陽性細胞比例。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分 SHI-1細胞株的TIMP-2、MTl-MMP、MMP-2的mRNA表達和蛋白表達均高于其它細胞株(P<.05)。SHI-1細胞無血清培養(yǎng)以及和BMSC共培養(yǎng)24h后上清中的proMMP-2(72KDa)和活化的MMP-2(62KDa)含量及體外侵襲率均

8、高于其它細胞株(P<.05)。并且共培養(yǎng)24h后proMMP-2的分泌、MMP-2的活化和體外侵襲率均高于單獨培養(yǎng)的(P<.05)。BMSC單獨培養(yǎng)24h后的上清中檢測不到proMMP-2的分泌和MMP-2的活化，直到48h才能檢測到，72h后達高峰。RNA干擾沉默TIMP-2、MTl-MMP、MMP-2基因的效率為85％-98％。基因沉默SHI-1細胞TIMP-2、MMP-2、MTl-MMP后，細胞侵襲率均分別下降60％-70％、50

9、％-60％、40％-50％(P<.05)。干擾后的條件培養(yǎng)基中檢測不到活化的MMP-2片段。RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)染了TIMP-2 cDNA的多克隆細胞和單克隆細胞均有外源性TIMP-2基因的整合和表達。單克隆細胞S1、S2、S3 TIMP-2的mRNA表達水平分別是SHI-1細胞的3.2倍、2.2倍、1.7倍(P<.05)，蛋白表達水平分別上調(diào)2.6倍、1.9倍、1.5倍(P<.01)，體外侵襲率增加了1.5倍-2.5倍(P<.05)，活

10、化的MMP-2增加了1.5倍-3倍(P<.01)。單克隆細胞的MTl-MMP、MMP-2的表達和條件培養(yǎng)基中的proMMP-2表達和SHI-1細胞沒有差異。
　　 第二部分對照組裸鼠注射后1-2周進食減少、體重下降、消瘦，2周后逐漸恢復(fù)正常，生存期大于60天以上而無死亡。SHI-1組和MOCK組裸鼠尾靜脈注射細胞后，同樣1-2周進食減少、體重下降、消瘦，2周后漸漸恢復(fù)，但5-6周左右再次出現(xiàn)進食減少，體重下降，部分裸鼠出現(xiàn)雙下肢

11、的癱瘓，眼、頭顱等部位腫塊生長，并逐漸衰竭死亡。SHI-1組中位生存期45天(40-48天)，MOCK組中位生存期44天(39-49天)。S1、S2和S3細胞注射組裸鼠發(fā)病時間較SHI-1組提前，注射細胞后4-5周即再次出現(xiàn)進食減少，體重下降，部分裸鼠雙下肢癱瘓，眼、頭顱等部位腫塊生長，并逐漸衰竭死亡。中位生存期S1組35天(33-38天)、S2組38天(35-42天)、S3組39天(37-43天)。MOCK組裸鼠生存期與SHI-1組無

12、差別，S1、S2和S3細胞注射組裸鼠較SHI-1組生存期縮短(P<.05)。對照組裸鼠的各臟器組織無異常病理改變，實驗組各組胃、肝臟、肺、腎臟、腦等多臟器組織均出現(xiàn)明顯的白血病細胞浸潤。S1、S2和S3細胞注射組裸鼠骨髓淙片中人白血病細胞的比例大于SHI-1組(P<.05)。除空白對照組外，各組裸鼠體內(nèi)形成的腫塊、肝臟、腎臟、肺、睪丸、心臟、胃、腦、腸以及骨髓中均擴增出MLL/AF6融合基因，并且SI、S2和S3組裸鼠臟器累及多于SHI

13、-1組和MOCK組(P<.05)?？瞻讓φ战M裸鼠骨髓中未檢測到人CD45陽性細胞，S1、S2和S3細胞注射組裸鼠中人CD45陽性細胞的表達高于SHI-1組和MOCK組(P<.05)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)本研究發(fā)現(xiàn)SHI-1細胞在mRNA水平和蛋白水平均高表達TIMP-2、MTl-MMP, MMP-2.
　　 (2)TIMP-2、MTl-MMP、MMP-2這些分子的高表達通過促進MMP-2的活化，增強了SH

14、I-1細胞的體外侵襲力。
　　 (3)骨髓基質(zhì)細胞和SHI-1細胞共培養(yǎng)增強了細胞的體外侵襲力。
　　 (4)內(nèi)源性上調(diào)1.5倍-2.5倍的TIMP-2不但增強了SHI-1細胞的體外侵襲力，而且使SHI-1細胞在裸鼠體內(nèi)形成了更為廣泛和嚴重的白血病浸潤，從而導(dǎo)致裸鼠白血病的發(fā)病時間提前，生存期縮短。因此上調(diào)TIMP-2對SHI-1細胞的體內(nèi)外侵襲力發(fā)揮的均是增強作用，而不是抑制作用。
　　 綜上所述：本研究表明S

15、HI-1細胞在mRNA和蛋白水平結(jié)構(gòu)性高表達MMP-2、MTl-MMP、TIMP-2。上調(diào)1.5倍-2.5倍TIMP-2不但和高表達TIMP-2、MMP-2、MTl-MMP一樣在骨髓基質(zhì)細胞存在的條件下通過促進MMP-2的活化增強了細胞的體外侵襲力，而且增強了SHI-1細胞的體內(nèi)侵襲力，在裸鼠體內(nèi)形成了更為廣泛和嚴重的白血病浸潤。本研究結(jié)果提示對伴有EMI的AML患者，尤其是高表達MMP-2和MTl-MMP的，增加TIMP-2反而導(dǎo)致負