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文檔簡介
1、目的:⑴探討順鉑(cisplatin,DDP)及電離輻射(ionizing radiation,IR)對鼻咽癌細(xì)胞株增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的影響。⑵探討小干擾RNA(Small-interference RNA, siRNA)下調(diào)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78,GRP78)對鼻咽癌細(xì)胞增殖抑制及凋亡的影響。
方法:①M(fèi)TT法探討DDP(2,4,8,16,32μM)、IR(2,4,6,8,
2、10Gy)處理人鼻咽癌細(xì)胞HNE1,HNE1/DDP24、48h后對細(xì)胞存活率的影響,以明確其劑量-效應(yīng)關(guān)系;②PI單染,PI/Annexin V雙染及線粒體膜電位JC-1流式檢測DDP(6μM)、IR(4Gy)對人鼻咽癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的影響;③Western blot法探討DDP(6μM)處理人鼻咽癌細(xì)胞HNE1,HNE1/DDP6、16、24h后對人鼻咽癌細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78表達(dá)的影響以及探討IR(2,4,6,8,10G
3、y)處理人鼻咽癌細(xì)胞HNE1,HNE1/DDP24h后對GRP78表達(dá)的影響;④siRNA法下調(diào)GRP78后,MTT法檢測細(xì)胞的存活率,Western blot法檢測鼻咽癌細(xì)胞中GRP78及其他凋亡蛋白的表達(dá), PI/Annexin V雙染檢測細(xì)胞凋亡的影響;
結(jié)果:⑴MTT法顯示:4μMDDP作用于人鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP、HNE124、48h后細(xì)胞存活率分別為92.8%、60.13%、和85.68%、49.34%。HN
4、E1/DDP的IC50=24.96,HNE1的的IC50=6.3,RI=6.96。⑵6μM DDP刺激人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP24h后,PI/Annexin V流式檢測,誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP的凋亡率分別為23.4%和10.1%,與陰性對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義;PI流式檢測,誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP的凋亡率分別為11.4%和6.6%,與陰性對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義;線粒體膜電位JC-1檢測
5、,人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP的平均熒光強(qiáng)度(紅光的平均熒光強(qiáng)度/綠光的平均熒光強(qiáng)度)為3.05、1.89,與陰性對照5.15、2.02相比,有統(tǒng)計學(xué)意義。⑶經(jīng)6μM DDP處理人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP6、16、24h后,Western blot法檢測了凋亡蛋白Caspase-3在HNE1中自16h起出現(xiàn)剪切,而在HNE1/DDP沒有出現(xiàn)剪切。⑷ MTT法顯示:4Gy IR作用于人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/D
6、DP24、48h后細(xì)胞存活率分別為77.3%、89.5%和85.8%、93.0%。⑸4Gy IR處理人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP24h后,PI/Annexin V流式檢測,誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP的凋亡率分別為30.4%和12.4%,與陰性對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義;PI流式檢測,誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP的凋亡率分別為28.1%和15.9%,與陰性對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義;線粒體膜電位JC-1檢測
7、,人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP的平均熒光強(qiáng)度(紅光的平均熒光強(qiáng)度/綠光的平均熒光強(qiáng)度)為2.68、1.34,與陰性對照5.15、2.02相比,有統(tǒng)計學(xué)意義。⑹經(jīng)6μM DDP處理人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP6、16、24h后,用Western blot法檢測了人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志蛋白GRP78的表達(dá),在HNE1/DDP中呈時間依賴性上調(diào),自6h起逐漸升高,24h達(dá)到高峰,但在HN
8、E1中上調(diào)趨勢不明顯。⑺經(jīng)2、4、6、8、10Gy IR處理人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP24h后,Western blot法檢測了人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志蛋白GRP78的表達(dá),在HNE1/DDP中呈劑量依賴性上調(diào),自2Gy起逐漸升高,10Gy達(dá)到高峰,但在HNE1中上調(diào)趨勢不明顯。⑻將不同序列的siRNA-GRP78和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP中,用Western blot法檢測
9、了鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP中 GRP78的表達(dá),與對照轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比,轉(zhuǎn)染siRNA-GRP78組中GRP78表達(dá)明顯降低。⑼將鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP進(jìn)行轉(zhuǎn)染后,MTT法顯示,與對照轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比,轉(zhuǎn)染siRNA-GRP78組中,鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP的存活率明顯下降,說明GRP78在鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP中具有保護(hù)作用。⑽將鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP進(jìn)行轉(zhuǎn)染后,PI/Annexin V流式檢測,與對照轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比
10、,轉(zhuǎn)染siRNA-GRP78組中,鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP的凋亡率明顯上升,說明GRP78在鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP中具有保護(hù)作用。⑾將鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP進(jìn)行轉(zhuǎn)染后,PI/Annexin V流式檢測單用DDP組、IR組、下調(diào)GRP78與DDP合用組,下調(diào)GRP78與IR合用組,后者的凋亡率明顯升高,與單用DDP組、IR組相比,具有統(tǒng)計學(xué)意義。⑿將鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP進(jìn)行轉(zhuǎn)染后,Western blot方法檢測下調(diào)GRP
11、78后,促凋亡蛋白Bax、Bak、Puma表達(dá)上調(diào)和抑凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1的表達(dá)下調(diào)。
結(jié)論:①DDP、IR對人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP具有增殖抑制作用,且隨著照射劑量和 DDP濃度的加大和作用時間的延長,細(xì)胞存活率隨之降低,但HNE1/DDP細(xì)胞對DDP、IR誘導(dǎo)的增殖抑制及凋亡不敏感。作用機(jī)制可能與DDP、IR誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵蛋白GRP78的保護(hù)作用相關(guān)。②DDP、IR誘導(dǎo)后,HNE1/DDP中G
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