siRNA沉默葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78增強(qiáng)人鼻咽癌細(xì)胞對順鉑及放療的敏感性.pdf

1、目的：⑴探討順鉑（cisplatin，DDP）及電離輻射（ionizing radiation，IR）對鼻咽癌細(xì)胞株增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的影響。⑵探討小干擾RNA(Small-interference RNA， siRNA)下調(diào)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78，GRP78)對鼻咽癌細(xì)胞增殖抑制及凋亡的影響。
　　方法：①M(fèi)TT法探討DDP(2，4，8，16，32μM)、IR(2，4，6，8，

2、10Gy)處理人鼻咽癌細(xì)胞HNE1，HNE1/DDP24、48h后對細(xì)胞存活率的影響，以明確其劑量-效應(yīng)關(guān)系；②PI單染，PI/Annexin V雙染及線粒體膜電位JC-1流式檢測DDP（6μM）、IR（4Gy）對人鼻咽癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的影響；③Western blot法探討DDP（6μM）處理人鼻咽癌細(xì)胞HNE1，HNE1/DDP6、16、24h后對人鼻咽癌細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78表達(dá)的影響以及探討IR(2，4，6，8，10G

3、y)處理人鼻咽癌細(xì)胞HNE1，HNE1/DDP24h后對GRP78表達(dá)的影響；④siRNA法下調(diào)GRP78后，MTT法檢測細(xì)胞的存活率，Western blot法檢測鼻咽癌細(xì)胞中GRP78及其他凋亡蛋白的表達(dá)， PI/Annexin V雙染檢測細(xì)胞凋亡的影響；
　　結(jié)果：⑴MTT法顯示：4μMDDP作用于人鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP、HNE124、48h后細(xì)胞存活率分別為92.8％、60.13%、和85.68%、49.34%。HN

4、E1/DDP的IC50=24.96，HNE1的的IC50=6.3，RI=6.96。⑵6μM DDP刺激人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP24h后，PI/Annexin V流式檢測，誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP的凋亡率分別為23.4%和10.1%，與陰性對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義；PI流式檢測，誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP的凋亡率分別為11.4%和6.6%，與陰性對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義；線粒體膜電位JC-1檢測

5、，人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP的平均熒光強(qiáng)度（紅光的平均熒光強(qiáng)度/綠光的平均熒光強(qiáng)度）為3.05、1.89，與陰性對照5.15、2.02相比，有統(tǒng)計學(xué)意義。⑶經(jīng)6μM DDP處理人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP6、16、24h后，Western blot法檢測了凋亡蛋白Caspase-3在HNE1中自16h起出現(xiàn)剪切，而在HNE1/DDP沒有出現(xiàn)剪切。⑷ MTT法顯示：4Gy IR作用于人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/D

6、DP24、48h后細(xì)胞存活率分別為77.3%、89.5%和85.8%、93.0%。⑸4Gy IR處理人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP24h后，PI/Annexin V流式檢測，誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP的凋亡率分別為30.4%和12.4%，與陰性對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義；PI流式檢測，誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP的凋亡率分別為28.1%和15.9%，與陰性對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義；線粒體膜電位JC-1檢測

7、，人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP的平均熒光強(qiáng)度（紅光的平均熒光強(qiáng)度/綠光的平均熒光強(qiáng)度）為2.68、1.34，與陰性對照5.15、2.02相比，有統(tǒng)計學(xué)意義。⑹經(jīng)6μM DDP處理人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP6、16、24h后，用Western blot法檢測了人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志蛋白GRP78的表達(dá)，在HNE1/DDP中呈時間依賴性上調(diào)，自6h起逐漸升高，24h達(dá)到高峰，但在HN

8、E1中上調(diào)趨勢不明顯。⑺經(jīng)2、4、6、8、10Gy IR處理人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP24h后，Western blot法檢測了人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志蛋白GRP78的表達(dá)，在HNE1/DDP中呈劑量依賴性上調(diào)，自2Gy起逐漸升高，10Gy達(dá)到高峰，但在HNE1中上調(diào)趨勢不明顯。⑻將不同序列的siRNA-GRP78和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP中，用Western blot法檢測

9、了鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP中 GRP78的表達(dá)，與對照轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-GRP78組中GRP78表達(dá)明顯降低。⑼將鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，MTT法顯示，與對照轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-GRP78組中，鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP的存活率明顯下降，說明GRP78在鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP中具有保護(hù)作用。⑽將鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，PI/Annexin V流式檢測，與對照轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比

10、，轉(zhuǎn)染siRNA-GRP78組中，鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP的凋亡率明顯上升，說明GRP78在鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP中具有保護(hù)作用。⑾將鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，PI/Annexin V流式檢測單用DDP組、IR組、下調(diào)GRP78與DDP合用組，下調(diào)GRP78與IR合用組，后者的凋亡率明顯升高，與單用DDP組、IR組相比，具有統(tǒng)計學(xué)意義。⑿將鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，Western blot方法檢測下調(diào)GRP

11、78后，促凋亡蛋白Bax、Bak、Puma表達(dá)上調(diào)和抑凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1的表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論：①DDP、IR對人鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP具有增殖抑制作用，且隨著照射劑量和 DDP濃度的加大和作用時間的延長，細(xì)胞存活率隨之降低，但HNE1/DDP細(xì)胞對DDP、IR誘導(dǎo)的增殖抑制及凋亡不敏感。作用機(jī)制可能與DDP、IR誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵蛋白GRP78的保護(hù)作用相關(guān)。②DDP、IR誘導(dǎo)后，HNE1/DDP中G