沉默Polemon基因提高鼻咽癌放射敏感性的研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 鼻咽癌是常見的惡性腫瘤之一，80％發(fā)生在中國。鼻咽癌由于解剖位置特殊，放射治療是其主要治療手段。近年來隨著診斷技術(shù)的發(fā)展，放療技術(shù)的不斷改進(jìn)及各種有效治療手段的應(yīng)用，療效進(jìn)一步提高，但5年生存率仍徘徊在70-80％左右。放射治療是鼻咽癌的主要治療手段，若在放射線殺滅癌細(xì)胞同時應(yīng)用基因治療提高鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性，有可能獲得更好的療效。
　　 近年來，隨著分子生物學(xué)，腫瘤免疫學(xué)等領(lǐng)域的進(jìn)步和發(fā)展，

2、相關(guān)基因的克隆及表達(dá)成功，使腫瘤的基因治療成為可能，并有望成為繼手術(shù)、放療、化療及免疫治療后又一重要的治療手段。眾多的基因治療中，針對自殺基因的治療最引人矚目，但臨床療效并不令人滿意。近年來有學(xué)者嘗試?yán)梅派渚€來實現(xiàn)對轉(zhuǎn)移基因體內(nèi)表達(dá)的時空調(diào)控，能提高基因靶向表達(dá)的效率，同時發(fā)現(xiàn)基因治療還可以提高腫瘤對放射線的敏感性，取得了令人鼓舞的效果。
　　 RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是指在進(jìn)化過程中高度保守的、

3、由雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。近幾年來RNAi研究取得了突破性進(jìn)展，被《Science》雜志評為2001年的十大科學(xué)進(jìn)展之一，并名列2002年十大科學(xué)進(jìn)展之首。由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。RNAi作為一種高效的序列特異性基因剔除技術(shù)在傳染性疾病和惡性腫瘤基因治療領(lǐng)

4、域發(fā)展極為迅速。
　　 原癌基因Pokemon(zbtb7基因)位于人類染色體19p13.3區(qū)域，全長21600bP。Pokemon基因mRNA長4456bp，該基因由2個外顯子構(gòu)成，其中含有一個開放的閱讀框，編碼含584個氨基酸殘基的Pokemon蛋白，分子量為61.5kD。研究表明，Pokemon可能是通過抑制抑癌基因ARF的轉(zhuǎn)錄來發(fā)揮致癌作用，通過Pokemon↑→ARF↓→MDM2↑→p53↓→腫瘤發(fā)生這一致癌模式而發(fā)揮

5、促進(jìn)腫瘤生長的作用。目前發(fā)現(xiàn)原癌基因Pokemon在一些人類腫瘤如淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和膀胱癌等腫瘤中存在高表達(dá)。在鼻咽癌細(xì)胞，Pokemon基因也存在高表達(dá)。野生型P53作為Pokemon基因的效應(yīng)基因，當(dāng)基因組的DNA受到損害時，參與受損DNA的修復(fù);如果修復(fù)失敗，野生型P53將會啟動細(xì)胞程序性死亡過程，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明:將野生型p53基因?qū)肽[瘤細(xì)胞后能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長，增加腫瘤細(xì)胞的凋亡率。Pokem

6、on基因是一種新的似乎控制著細(xì)胞突變的整個過程對癌癥形成至關(guān)重要的癌基因，它是其他癌基因引發(fā)癌癥所必須的，此前發(fā)現(xiàn)的致癌基因都不具備類似功能。
　　 腺病毒、慢病毒載體及原核表達(dá)和真核表達(dá)系統(tǒng)，常用于特定基因的產(chǎn)物表達(dá)。在實驗和臨床治療中經(jīng)常使用的的病毒載體有腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺相關(guān)病毒載體等，其中由于腺病毒載體轉(zhuǎn)染效率高、插入外源基因片段大、CMV啟動的宿主范圍廣、高病毒滴度、易濃縮貯存、介導(dǎo)外源基因短時呈高水平表達(dá)

7、以及不整合到感染細(xì)胞的基因組中等優(yōu)點，使得腺病毒載體成為目前基因治療研究和臨床試驗中應(yīng)用最為廣泛的病毒載體之一。
　　 目前所采用的病毒載體如腺病毒載體，利用高效的基因轉(zhuǎn)移載體系統(tǒng)，可以有效地將基因治療和放射治療結(jié)合起來，發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，是腫瘤基因治療的重要方向之一。腺病毒是一種雙鏈DNA病毒，正常寄生于人體上呼吸道，一般不會引起人體疾病，也無致瘤性報道。腺病毒的不整合、不致瘤性使其具有較好的安全性?；蛑委煏r載體基因組上的E1A

8、和E1B基因已被目的基因所取代，因而在普通細(xì)胞內(nèi)缺乏復(fù)制能力;只有在染色體已整合有E1A和E1B的包裝細(xì)胞(如293細(xì)胞)中，復(fù)制能力缺陷型的重組腺病毒才能包裝成完整的腺病毒顆粒。腺病毒對實體瘤細(xì)胞有很高的感染能力，如肝癌、肺癌、鼻咽癌等。
　　 因此，本項目通過采用對Pokemon進(jìn)行基因沉默的RNAi(RNA interference，RNA干擾)技術(shù)，將沉默Pokemon基因的siRNA片段及野生型p53基因重組入缺陷型腺

9、病毒中，構(gòu)建出重組腺病毒后，將感染重組腺病毒的鼻咽癌細(xì)胞CNE-2進(jìn)行放射治療，分別從mRNA和蛋白質(zhì)水平進(jìn)行檢測治療前后Pokemon、p53、P14ARF基因的表達(dá)情況，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況，分析其是否能提高鼻咽癌對放射治療的敏感性。
　　 方法：
　　 1.鼻咽癌細(xì)胞株的培養(yǎng)
　　 CNE-2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)箱條件:5％CO2、37℃恒溫。按常規(guī)條件消化傳代。

10、r>　　 2.靶向Pokemon基因的siRNA片段合成
　　 根據(jù)NCBIGenBank上公布的Pokemon基因(NM_015898)全長序列，遵循siRNA的設(shè)計原則，利用在線軟件篩選出3條序列交由廣州市銳博生物科技有限公司合成，所選擇的序列通過BLAST在GenBank上比對，證明所選擇的序列與其他基因沒有同源性。實驗同時以GACATCATAGGTCGCATGC作為陰性對照組的干擾序列，此序列不與任何人類基因序列同源。

11、
　　 3.siRNA片段轉(zhuǎn)染
　　 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種于6孔板及96孔板內(nèi)，待細(xì)胞達(dá)到85％-90％的融合時，按照LIPOFECTAMINERNAIMAX試劑盒操作步驟及試劑配制比例，加入轉(zhuǎn)染試劑及siRNA片段，4小時后加入新鮮培養(yǎng)液。
　　 4.Pokemon基因表達(dá)的檢測
　　 應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測Pokemon基因RNA的表達(dá)。收集轉(zhuǎn)染后24h的CNE-2細(xì)胞用TRI

12、zol法提取總RNA。取擴(kuò)增后的產(chǎn)物5μL進(jìn)行2％的瓊脂糖凝膠電泳。采用免疫印跡法(Western blot)檢測Pokemon蛋白的表達(dá)。收集轉(zhuǎn)染后24h的CNE-2細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液抽提細(xì)胞總蛋白，Bradford法檢測總蛋白濃度，取50μg總蛋白進(jìn)行電泳。然后在KODAK IMAGE STATION 2000R成像儀上進(jìn)行拍照，利用SensiAnsys圖像分析軟件分析電泳條帶的灰度值，檢測Pokemon基因及蛋白的表達(dá)強度。

13、>　　 5.P14ARF、p53基因表達(dá)的檢測
　　 應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測P14ARF、p53基因RNA的表達(dá)。收集轉(zhuǎn)染后24h的CNE-2細(xì)胞用TRIzol法提取總RNA。取擴(kuò)增后的產(chǎn)物5μL進(jìn)行2％的瓊脂糖凝膠電泳。采用免疫印跡法(Western blot)檢測Pokemon蛋白的表達(dá)。收集轉(zhuǎn)染后24h的CNE-2細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液抽提細(xì)胞總蛋白，Bradford法檢測總蛋白濃度，取50μg總蛋白進(jìn)行

14、電泳。然后在KODAK IMAGE STATION 2000R成像儀上進(jìn)行拍照，利用SensiAnsys圖像分析軟件分析電泳條帶的灰度值，檢測P14ARF、P53基因及蛋白的表達(dá)強度。
　　 6.細(xì)胞增殖活性的檢測
　　 采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞的增殖活性。將轉(zhuǎn)染處理組及空白對照組中處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以3000個/孔接種96孔板，分別于6、12、24、48及72h分別棄去培養(yǎng)基，每孔加入5g/L的MTT溶液繼續(xù)培

15、養(yǎng)4h，棄去MTT，各孔中加入150μL的DMSO，室溫下震蕩10min，在酶標(biāo)儀A490nm處測定各孔的吸光度值(A值)，繪制細(xì)胞的生長曲線，并計算細(xì)胞的生長抑制率。
　　 7.平板克隆形成實驗
　　 經(jīng)胰酶消化后，使用6孔板，每孔種入200個細(xì)胞，使用完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天，待顯著的細(xì)胞集落形成時使用多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計數(shù)含＞50個細(xì)胞的細(xì)胞克隆數(shù)。
　　 8.Transwell遷移實驗

16、>　　 經(jīng)胰酶消化后，以無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，制作細(xì)胞懸液，加入200ul至transwell小室上腔，transwell小室下腔加入600ul培養(yǎng)基，12小時后洗滌，多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色液染色，顯微鏡下計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。
　　 9.細(xì)胞凋亡的檢測
　　 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡。收集對數(shù)生長期CNE-2細(xì)胞1×106，按照試劑盒步驟1000rpm離心10分鐘，加入預(yù)冷PBS洗滌3次，將細(xì)胞重懸于200μL的Bi

17、ndingBuffer，加入10μLAnnexinV-FITC，混勻，避光室溫反應(yīng)15min，上機前5min加入10μL碘化吡啶，再加入300μL的BindingBuffer，1h內(nèi)上機檢測。以各組中凋亡細(xì)胞占總計數(shù)細(xì)胞的百分比計算凋亡率。
　　 10.Pokemon基因重組腺病毒的構(gòu)建與鑒定
　　 ①重組質(zhì)粒pAdTrack-CMV-Pokemon的構(gòu)建
　　 合成pre-Pokemon轉(zhuǎn)錄模板正義鏈和反義鏈的

18、DNAOligo序列，退火形成DNA雙鏈后與pAdTrack載體同時進(jìn)行KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切，連接以構(gòu)建載體pAdTrack-CMV-Pokemon。
　　 ②重組腺病毒質(zhì)粒pAd-Pokemon的構(gòu)建
　　 將經(jīng)鑒定序列正確的含有GFP(綠色熒光蛋自)標(biāo)記的pAdTrack-CMV-Pokemon質(zhì)粒KpnⅠ酶切線性化后，與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1電穿孔發(fā)共轉(zhuǎn)化。經(jīng)鑒定正確的克隆命名為pAd-si-Poke

19、mon。制備腺病毒空載體作為陰性對照組。
　　 ③腺病毒的包裝與滴度測定
　　 取5μg重組質(zhì)粒使用LIPOFECTAMINE RNAIMAX(Invitrogene)的方法轉(zhuǎn)染到293A細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝。經(jīng)擴(kuò)增、純化后使用病毒噬斑形成實驗測定病毒滴度。
　　 ④重組腺病毒蛋白表達(dá)鑒定
　　 純化后的病毒以MOI(multiplicity of infection)為10感染293A細(xì)胞，感染48h，細(xì)

20、胞按Trizol法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用免疫熒光和Western Blotting法檢測上清中Pokemon蛋白的表達(dá)。
　　 11.體外功能實驗
　　 ①細(xì)胞增殖活性的檢測
　　 采用MTT(噻唑藍(lán))法檢測CNE-2細(xì)胞的增殖活性。將處于對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染組及對照組細(xì)胞接種96孔板(3000個/孔)，選取6h、12h、24h、48h及72h時間點棄去培養(yǎng)基，每孔加入MTT溶液(5g/L)繼

21、續(xù)培養(yǎng)4h，棄去MTT溶液，每孔加入DMSO溶液150μL，室溫下震蕩10分鐘，酶標(biāo)儀A490nm處測定每孔的吸光度光度值(A值)，然后繪制CNE-2細(xì)胞生長曲線圖。
　　 ②平板克隆形成實驗
　　 經(jīng)胰酶消化后，使用6孔板，每孔種入200個細(xì)胞，使用完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天，待顯著的細(xì)胞集落形成時使用多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計數(shù)含＞50個細(xì)胞的細(xì)胞克隆數(shù)。
　　 ③細(xì)胞凋亡狀態(tài)的檢測
　　 利用

22、流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡檢測CNE-2細(xì)胞的凋亡狀態(tài)。
　　 ④Transwell遷移實驗
　　 經(jīng)胰酶消化后，以無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，制作細(xì)胞懸液，加入200ul至transwell小室上腔，transwell小室下腔加入600ul培養(yǎng)基，12小時后洗滌，多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色液染色，顯微鏡下計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。
　　 12.克隆形成法檢測CNE-2細(xì)胞的放射敏感性
　　 取對數(shù)生長期CNE-2細(xì)胞，用胰蛋白酶

23、消化后制成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后用梯度稀釋至所需濃度:1×101、1×102、2×103、1×104、1×105、1×106個細(xì)胞分別接種于60mm培養(yǎng)皿中，分別使用0、2、4、6、8、10Gy的劑量照射，采用西門子直線加速器照射(6MVX線，射野大小20cm×20cm，SSD=100cm，機架角180度，下墊1.5cm等效膜)，每個照射劑量均設(shè)3個平行樣品。然后將培養(yǎng)皿在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。2周后將各組CNE-2細(xì)胞用9

24、5％乙醇固定，Giemsa染色后計數(shù)(＞50個細(xì)胞計數(shù)為一個存活集落)，計算存活分?jǐn)?shù)(survivingfraction，SF)和克隆形成率。應(yīng)用單擊多靶數(shù)學(xué)模型(single-hitmultitargetmodel)計算D0值(平均致死劑量)和Dq值(準(zhǔn)域劑量)。使用GraphPadPrism4.0軟件擬合細(xì)胞存活曲線。
　　 統(tǒng)計學(xué)處理
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)

25、意義。所得數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，多組的組間比較應(yīng)用單因素方差分析(One-WayANOVA)，方差不齊時使用Welch校正，在差異顯著地前提下進(jìn)行多重比較，方差齊時采用LSD法，方差不齊時采用Dunnett'T3法。pAd-si-Pokemon腺病毒后Pomemon基因及蛋白的表達(dá)的兩樣本均數(shù)使用配對t檢驗。MTT結(jié)果使用析因設(shè)計資料的方差分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.設(shè)計的三條siRNA序列轉(zhuǎn)染C

26、NE-2細(xì)胞后，PCR產(chǎn)物電泳帶結(jié)果顯示各組的抑制率分別為Si-h-ZBTB7A_001組為47.51％，Si-h-ZBTB7A_002組為74.88％，Si-h-ZBTB7A_003組為44.52％，與陰性對照組和正常組相比，表達(dá)抑制率差異有顯著意義。Westernblot產(chǎn)物電泳帶結(jié)果顯示各組的抑制率分別為Si-h-ZBTB7A_001組為40.08％，Si-h-ZBTB7A_002組為72.36％，Si-h-ZBTB7A_003組

27、為34.64％，與陰性對照組和正常組相比，表達(dá)抑制率差異有顯著意義。三組比較，Si-h-ZBTB7A_002組較其他兩組抑制效果更好(P＜0.05)。
　　 2.轉(zhuǎn)染Si-h-ZBTB7A_002組siRNA后，P14ARF基因的表達(dá)較陰性對照組和空白組表達(dá)升高(P＜0.05)，P14ARF蛋白的表達(dá)較陰性對照組和空白組表達(dá)升高(P＜0.05);P53基因的表達(dá)較陰性對照組和空白組表達(dá)升高(P＜0.05)，P53蛋白的表達(dá)較陰性

28、對照組和空白組表達(dá)升高(P＜0.05)。
　　 3.轉(zhuǎn)染Si-h-ZBTB7A_002組siRNA后對鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響。MTT法所測的CNE-2細(xì)胞干擾前后生長曲線顯示RNAi后細(xì)胞增殖速度減慢，細(xì)胞生長受到抑制(P＜0.05);平板克隆實驗顯示，RNAi后CNE-2細(xì)胞形成的細(xì)胞克隆數(shù)(47.33±1.15)顯著小于陰性對照組(83.67±1.15)和正常組(84.33±1.53);鋪板12小時后，CNE

29、-2細(xì)胞穿透基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)(36.33±1.53)較陰性對照組(94.67±2.52)和正常組(94.33±3.51)顯著減少。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡，RNAi后CNE-2細(xì)胞凋亡率(23.533±0.016％)較陰性對照組(9.187±0.002％)和正常組(9.227±0.003％)顯著升高。
　　 4.構(gòu)建的重組腺病毒質(zhì)粒pAd-Pokemon經(jīng)擴(kuò)增、純化后病毒滴度可達(dá)4.6×1012VP/ml。經(jīng)RT-PCR可以擴(kuò)增出

30、與目的基因大小一致的片段。超濾濃縮的細(xì)胞上清經(jīng)電泳轉(zhuǎn)印顯色后顯示，接種重組腺病毒pAd-Pokemon的293細(xì)胞上清在1371bp左右有一條顯著的條帶，與預(yù)期分泌性的Pokemon基因大小一致。
　　 5.感染腺病毒pAd-Pokemon、pAd-53后對鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響。MTT法所測的CNE-2細(xì)胞干擾前后生長曲線顯示RNAi后細(xì)胞增殖速度減慢，細(xì)胞生長受到抑制(P＜0.05=，pAd-p53組的CNE

31、-2細(xì)胞抑制率較pAd-si-Pokemon組更高(P＜0.05=;平板克隆實驗顯示，pAd-si-Pokemon組(54.00±2.65)、pAd-p53組(40.33±1.53)細(xì)胞形成的平板克隆數(shù)顯著少于對照組(83.33±2.08)(p＜0.001)，而pDNA-p53組得克隆形成數(shù)又少于pAd-si-Pokemon組。鋪板12小時后，pAd-si-Pokemon組(45.00±1.00)、pAd-p53組(33.00±2.64

32、)CNE-2細(xì)胞穿透基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)較對照組(82.67±1.53)顯著減少(P＜0.001)。pAd-p53組穿透基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)又顯著少于pAd-si-Pokemon組。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡，pAd-si-Pokemon組CNE-2細(xì)胞凋亡率(22.6±0.005％)，pAd-p53組CNE-2細(xì)胞凋亡率(35.6±0.008％)，較陰性對照組(9.2±0.003％)顯著升高。pAd-p53組的CNE-2細(xì)胞凋亡率較pAd-si-P

33、okemon組更高(P＜0.05)。
　　 6.鼻咽癌CNE-2細(xì)胞經(jīng)腺病毒pAd-Pokemon、pAd-53感染前后前后D0值分別為:1.989±0.017、2.309±0.477;Dq值分別2.363±0.047、2.773±0.031。pAd-Pokemon組和pAd-53組的放射增敏比SER值分別為1.25、1.16。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究所設(shè)計合成的Pokemon基因的siRNA可以有效、特

34、異地阻斷Pokemon基因的表達(dá);阻斷Pokemon基因可以阻止細(xì)胞增殖;抑制腫瘤遷移;誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　 2.本研究通過對pAd-Pokemon的重組腺病毒進(jìn)行包裝與擴(kuò)增、純化與鑒定，制備了高純度、高滴度的含pAd-Pokemon的重組腺病毒。
　　 3.攜帶pAd-Pokemon的重組腺病毒感染CNE-2細(xì)胞后可以阻止細(xì)胞增殖，抑制腫瘤細(xì)胞遷移，誘導(dǎo)凋亡增加。
　　 4.攜帶pAd-Pokemon的重組