Erbin對Her2陽性乳腺腺癌細(xì)胞的遷移能力及赫賽汀耐藥的影響及相關(guān)機制研究.pdf

1、目的:
　　 乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤之一，全球每年約120萬人被確診為乳腺癌，每年約有70萬人死于此類疾病，在所有癌癥引發(fā)的死亡中排名第三，僅次于肺癌和胃癌。乳腺癌的發(fā)病機制十分復(fù)雜，表皮生長因子受體2(Her2)在20-30％的乳腺癌中過表達(dá)，而且與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。因此探索Her2相互作用分子的生物學(xué)功能、闡明相關(guān)的分子機制對于深入了解Her2陽性乳腺癌的病理生理學(xué)過程及改善患者的預(yù)后具有重要意義。

2、　　 Erbin是應(yīng)用酵母雙雜技術(shù)研究Her2相互作用蛋白時被發(fā)現(xiàn)的，因其可與Her2發(fā)生直接的，特異的相互作用，故命名為Her2/ErbB2相互作用蛋白(ErBb2interactionprotein)，簡稱Erbin。Erbin廣泛表達(dá)于正常的上皮組織中。已有研究證實，Erbin可以負(fù)向調(diào)控Her2下游RAS-RAF-ERK信號通路的活化。但在Her2陽性乳腺癌中Erbin的表達(dá)水平及表達(dá)模式尚不清楚，Erbin在Her2陽性乳腺

3、癌中的生物學(xué)功能及對其惡性演進過程的影響亦未見報道。本次研究中，發(fā)現(xiàn)在Her2陽性乳腺癌組織中，Erbin的表達(dá)顯著降低，甚至出現(xiàn)了表達(dá)丟失的現(xiàn)象。實驗結(jié)果表明，在Her2陽性的乳腺癌細(xì)胞中敲低Erbin表達(dá)可明顯增強細(xì)胞的遷移能力，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞出現(xiàn)侵襲表型。同時還發(fā)現(xiàn)，敲低Erbin表達(dá)可誘導(dǎo)Her2陽性的乳腺癌細(xì)胞對治療性單抗赫賽汀產(chǎn)生抗性。分子機制的研究表明，敲低Erbin主要通過誘導(dǎo)AKT信號通路的異?；罨瘉韺崿F(xiàn)上述的生物學(xué)效

4、應(yīng)。這些結(jié)果提示，Erbin通過調(diào)控AKT信號通路影響乳腺癌細(xì)胞的遷移能力及對赫賽汀的耐藥，從而可能在Her2陽性乳腺癌的惡性演進過程中發(fā)揮著重要作用。
　　 方法:
　　 應(yīng)用Erbin特異性抗體、通過免疫組織化學(xué)染色在人乳腺癌組織芯片中檢測Erbin在蛋白水平的表達(dá)情況;通過Oncomine數(shù)據(jù)庫檢索，探索在Her2陽性的乳腺癌組織中Erbin在mRNA水平的表達(dá)情況;通過免疫印跡法及實時定量PCR檢測在乳腺癌細(xì)胞系

5、中，Erbin在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平的表達(dá)情況;設(shè)計并構(gòu)建了ErbinshRNA表達(dá)載體，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染、病毒感染以及蛋白質(zhì)免疫印跡，檢測在Her2陽性乳腺癌細(xì)胞中敲低Erbin表達(dá)對Heregulin誘導(dǎo)的AKT信號通路活化的影響;通過構(gòu)建Erbin真核表達(dá)載體、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及免疫印跡法檢測了，在Her2陽性的乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)Erbin對Heregulin誘導(dǎo)的AKT活化的影響;通過CCK8（細(xì)胞增殖檢測），探索敲低Erbin表達(dá)對Her2

6、陽性乳腺癌細(xì)胞增殖的影響;通過流式細(xì)胞術(shù)，檢測敲低Erbin表達(dá)對Her2陽性乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期行進的影響;通過二維培養(yǎng)條件下的細(xì)胞劃痕實驗，檢測了敲低Erbin表達(dá)對Her2陽性乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響;通過Matrigel細(xì)胞三維培養(yǎng)法，檢測敲低Erbin表達(dá)對Her2陽性乳腺癌細(xì)胞侵襲表型形成的影響;應(yīng)用AKT及ERK信號通路的特異性抑制劑，探索敲低Erbin影響細(xì)胞遷移及侵襲表型形成的分子機制;通過細(xì)胞增殖檢測實驗，檢測敲低E

7、rbin表達(dá)對靶向Her2的治療性抗體-赫賽汀細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)的影響;通過細(xì)胞海綿三維細(xì)胞培養(yǎng)法，檢測敲低Erbin對Her2陽性乳腺癌細(xì)胞赫賽汀耐藥的影響;通過細(xì)胞錨定非依賴增殖檢測法，探索敲低Erbin表達(dá)對Her2陽性乳腺癌細(xì)胞的赫賽汀敏感性的影響;應(yīng)用AKT及ERK特異性抑制劑，探索Erbin影響Her2陽性乳腺癌細(xì)胞赫賽汀耐藥的分子機制。
　　 結(jié)果:
　　 1、Erbin在乳腺癌及Her2陽性乳腺癌組織中表達(dá)

8、顯著降低
　　 免疫組化的結(jié)果表明，在所檢測的10例正常乳腺組織中，8例呈現(xiàn)Erbin高表達(dá)（++-+++）;而在20例浸潤性乳腺癌組織中，Erbin的表達(dá)水平普遍偏低，甚至出現(xiàn)了表達(dá)丟失的現(xiàn)象。15例乳腺癌組織Erbin的表達(dá)水平為“+”或陰性，僅5例為“++”。在Oncomine數(shù)據(jù)庫檢索時發(fā)現(xiàn)了一組含有53例浸潤性乳腺癌的樣本。通過與正常乳腺組織進行比較，發(fā)現(xiàn)這是一組高Her2陽性率的乳腺癌樣本，在53例樣本中有52例為H

9、er2陽性，僅有1例為Her2陰性。同時檢索了該組樣本中Erbin在mRNA水平的表達(dá)情況。結(jié)果表明，在52例樣本中ErbinmRNA的水平都顯著低于正常乳腺組織，僅有一例例外。這一發(fā)現(xiàn)與之前在乳腺癌組織芯片中檢測得到的結(jié)果相符，提示Erbin表達(dá)水平在Her2陽性乳腺癌組織中顯著下降。通過對該組患者的預(yù)后進行分析發(fā)現(xiàn)，與那些三年內(nèi)未出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)的患者相比，三年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)的患者標(biāo)本中Erbin表達(dá)水平的下調(diào)更為顯著。提示Erbin在He

10、r2陽性乳腺癌的惡性演進過程中可能發(fā)揮著重要作用。此外本次實驗還應(yīng)用Western-blot及實時定量RT-PCR法檢測了人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A及5種乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7、MCF-7/Her2、MDA-453、T47D、MDA-435)中檢測了Erbin在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)情況。實驗結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)錄水平，MCF-7、MCF-7/Her2及T47D細(xì)胞的Erbin表達(dá)明顯低于MCF-10A細(xì)胞。而MDA-453細(xì)胞Erbi

11、n表達(dá)顯著高于MCF-10A細(xì)胞。在蛋白水平，與MCF-10A細(xì)胞相比，MCF-7、MCF-7/Her2、MDA-453、MDA-435細(xì)胞Erbin的表達(dá)水平相對較低。
　　 2、Erbin可在Her2陽性乳腺癌細(xì)胞中負(fù)調(diào)控AKT信號通路的活化
　　 設(shè)計并構(gòu)建了ErbinshRNA的慢病毒表達(dá)載體，利用慢病毒感染的方法獲得了三株穩(wěn)定敲低Erbin的乳腺癌細(xì)胞（均為Her2陽性乳腺癌細(xì)胞），分別命名為MDA-453-E

12、rbin-sh、SKBR3-Erbin-sh和MCF-7/Her2-Erbin-sh。Western-blot檢測結(jié)果表明，在這三種感染ErbinshRNA慢病毒的細(xì)胞中，Erbin的表達(dá)被顯著抑制。同時，將感染表達(dá)對照shRNA慢病毒的細(xì)胞作為對照組。通過應(yīng)用Her2的激活分子Heregulin分別刺激上述乳腺癌細(xì)胞，檢測Her2下游的主要促生存信號通路的變化。實驗結(jié)果表明，在MCF-7/Her2對照細(xì)胞中，Heregulin的刺激可

13、以使AKT的磷酸化發(fā)生一個先升后降，如同“拋物線”樣的變化;但在MCF-7/Her2-Erbin-sh細(xì)胞中，Heregulin刺激所造成的AKT的磷酸化，無論強度還是持續(xù)的時間都明顯強于對照細(xì)胞。在MDA-453細(xì)胞中，Heregulin的刺激可以使對照細(xì)胞的AKT出現(xiàn)一個先快速磷酸化繼而緩慢下降的過程，雖然沉默Erbin的表達(dá)并沒有顯著提高p-AKT的水平，但是造成了AKT的持續(xù)活化，即使在刺激六小時后，其活化程度依然沒有明顯的衰減

14、。在SKBR3-Erbin-sh細(xì)胞中也得到了同樣的結(jié)果，即在高表達(dá)Her2的乳腺癌細(xì)胞中，Erbin表達(dá)下調(diào)可增強由Heregulin誘導(dǎo)的AKT的磷酸化。上述實驗表明，在高表達(dá)Her2的乳腺癌細(xì)胞中，Erbin表達(dá)的缺失可增強由Heregulin誘導(dǎo)及Her2激活所導(dǎo)致的AKT的磷酸化。為進一步探討Erbin對AKT信號通路的調(diào)控作用，實驗中構(gòu)建了Erbin的真核表達(dá)載體，并將其瞬時轉(zhuǎn)染Her2陽性乳腺癌細(xì)胞MCF-7/Her2和M

15、DA-453，轉(zhuǎn)染48小時后用無血清的培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞過夜，然后用Heregulin刺激細(xì)胞。WesternBlot的結(jié)果顯示，Erbin過表達(dá)可顯著抑制Heregulin誘導(dǎo)的AKT活化。這進一步證明了，在高表達(dá)Her2的乳腺癌細(xì)胞中，Erbin對于Heregulin誘導(dǎo)的AKT信號通路活化具有負(fù)向調(diào)控作用。
　　 3、Erbin缺失可促進AKT信號依賴的細(xì)胞遷移及侵襲
　　 為進一步探索Erbin表達(dá)降低在Her2陽性

16、乳腺癌惡性演進過程中的意義。首先通過體外劃痕實驗進行檢測敲低Erbin表達(dá)對Her2陽性乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果表明，在MCF-7/Her2細(xì)胞中敲低Erbin的表達(dá)可以顯著加速創(chuàng)口的愈合，而且在Heregulin存在的情況下這種促進作用更為明顯。實驗采用以基質(zhì)膠為基礎(chǔ)的三維細(xì)胞培養(yǎng)法探索Erbin對Her2陽性乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。實驗結(jié)果表明，對照細(xì)胞可以在三維細(xì)胞培養(yǎng)體系中形成邊緣規(guī)則的球形結(jié)構(gòu)，而大部分(80％)的Er

17、bin低表達(dá)細(xì)胞在三維體系中形成邊緣極不規(guī)則且具有侵襲樣結(jié)構(gòu)的球體。上述結(jié)果表明，在Her2陽性乳腺癌細(xì)胞中沉默Erbin表達(dá)，可增強細(xì)胞遷移和侵襲能力。為進一步探索此過程中的精確分子機制，在劃痕實驗中使用了AKT特異性的抑制劑GDC0941。Western-blot的結(jié)果表明，GDC0941可特異性抑制AKT的磷酸化，而不影響ERK的磷酸化。劃痕實驗的結(jié)果表明，GDC0941能夠顯著逆轉(zhuǎn)Erbin表達(dá)缺失對細(xì)胞遷移能力的影響，證實了A

18、KT的活化可能在此過程中發(fā)揮了重要作用。那么ERK作為Her2下游另一條重要的信號通路，它的激活是否也參與Erbin表達(dá)缺失誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移能力增強呢？為了回答這一問題，本次實驗選用了ERK的特異性抑制劑PD184352。結(jié)果表明，PD184352它可以在不影響AKT磷酸化的前提下，特異性抑制ERK的磷酸化。劃痕實驗的結(jié)果表明，PD184352并不能逆轉(zhuǎn)敲低Erbin表達(dá)所誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移。以上實驗結(jié)果表明，在Her2陽性的乳腺癌細(xì)胞中，E

19、rbin表達(dá)缺失以AKT信號通路依賴的方式促進Her2陽性乳腺癌細(xì)胞遷移及侵襲表型形成。
　　 4、敲低Erbin表達(dá)誘導(dǎo)AKT信號依賴的赫賽汀耐藥
　　 目前靶向Her2的治療性抗體-赫賽汀是Her2陽性乳腺癌的主要治療手段之一。然而赫賽汀耐藥是制約此藥物發(fā)揮療效及造成患者不良預(yù)后的重要原因。闡明赫賽汀耐藥的相關(guān)機制、發(fā)現(xiàn)預(yù)測及克服耐藥的分子靶標(biāo)具有重要意義。應(yīng)用不同濃度的赫賽汀分別處理表達(dá)對照shRNA及表達(dá)Erbi

20、nshRNA的MCF-7/Her2細(xì)胞。在連續(xù)刺激5天后，采用CCK8細(xì)胞增殖實驗，檢測了敲低Erbin表達(dá)對赫賽汀細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)的影響。實驗結(jié)果表明，在對照組細(xì)胞中，赫賽汀可顯著抑制細(xì)胞的增殖，并呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。在敲低Erbin的MCF-7/Her2細(xì)胞中，赫賽汀雖然可以在一定程度上抑制細(xì)胞增殖并具有量效關(guān)系。但是與對照細(xì)胞相比，相同濃度赫賽汀對敲低Erbin的MCF-7/Her2細(xì)胞的增殖抑制率顯著降低。這提示，敲低Erbi

21、n表達(dá)可能誘導(dǎo)Her2陽性乳腺癌細(xì)胞對赫賽汀產(chǎn)生耐藥。為進一步排除此現(xiàn)象的細(xì)胞特異性，實驗中選取MDA-453細(xì)胞重復(fù)進行了上述實驗。實驗結(jié)果表明，敲低Erbin表達(dá)可誘導(dǎo)MDA-453細(xì)胞對赫賽汀產(chǎn)生耐藥。
　　 由于在二維培養(yǎng)和三維培養(yǎng)條件下，腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性可能存在差異。本次實驗應(yīng)用細(xì)胞海綿(cellusponge)三維細(xì)胞培養(yǎng)法檢測了敲低Erbin表達(dá)對MDA-453細(xì)胞赫賽汀敏感性的影響。實驗結(jié)果顯示，赫賽汀可完

22、全抑制對照細(xì)胞在細(xì)胞海綿中的生長。而敲低Erbin表達(dá)不但可以增加MDA-453細(xì)胞在細(xì)胞海綿中的克隆體積，還可以誘導(dǎo)MDA-453細(xì)胞對赫賽汀產(chǎn)生耐藥。在接下來的實驗中，采用了軟瓊脂細(xì)胞克隆形成實驗進一步檢測了敲低Erbin表達(dá)對MDA-453細(xì)胞赫賽汀抗性的影響。實驗結(jié)果顯示，赫賽汀可顯著抑制對照細(xì)胞的錨定非依賴性生長，而在敲低Erbin的細(xì)胞中，這種抑制效應(yīng)顯著減弱。此結(jié)果進一步支持了這一假設(shè)，即Erbin表達(dá)缺失可誘導(dǎo)Her2陽

23、性乳腺癌細(xì)胞對赫賽汀產(chǎn)生抗性。
　　 為進一步探索敲低Erbin表達(dá)誘導(dǎo)Her2陽性乳腺癌細(xì)胞赫賽汀抗性的分子機制，本次實驗檢測了AKT及ERK信號通路在敲低Erbin表達(dá)誘導(dǎo)赫賽汀耐藥過程中的作用。通過細(xì)胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)，在對照細(xì)胞中赫賽汀可抑制AKT的誘導(dǎo)劑Heregulin誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。但是在敲低Erbin的細(xì)胞中，赫賽汀不能抑制Heregulin誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。AKT的抑制劑GDC0941可顯著逆轉(zhuǎn)由于敲低Erbin導(dǎo)致

24、的赫賽汀耐藥，而ERK特異性抑制劑PD184352不能逆轉(zhuǎn)敲低Erbin誘導(dǎo)的赫賽汀耐藥。這一結(jié)果提示，Erbin表達(dá)缺失主要通過誘導(dǎo)AKT信號的異常活化誘導(dǎo)Her2陽性乳腺癌細(xì)胞赫賽汀耐藥的發(fā)生。
　　 結(jié)論:
　　 1、在乳腺癌及Her2陽性乳腺癌組織中Erbin表達(dá)水平顯著下調(diào)
　　 2、在Her2陽性的乳腺癌細(xì)胞中Erbin負(fù)向調(diào)控了AKT信號通路。
　　 3、Erbin表達(dá)缺失以AKT信號通路依