誘導HIV-1中和抗體的膜蛋白抗原的優(yōu)化和改造.pdf

1、自1981年確認首例艾滋病以來，艾滋病已成為對人類健康和社會穩(wěn)定威脅最大的感染性疾病之一。研制有效的艾滋病疫苗是控制艾滋病流行甚至根除AIDS的理想途徑。選擇合適的抗原作為免疫原以誘導強效、廣譜的中和抗體一直是疫苗研究的重要的基礎。HIV-1膜抗原位于HIV的表面，是中和抗體主要作用靶位。但天然HIV-1膜蛋白免疫原性低，很難誘導出強效廣譜的中和抗體，因而需要對其進行優(yōu)化改造以提高中和表位的免疫原性，增強其誘導中和抗體的能力。本研究以一

2、株CRF07_BC亞型的假病毒株S939為原始株，對其膜區(qū)進行改造以暴露某些保守中和表位，通過單抗、陽性血清的中和試驗來驗證改造效果，最終獲得一株對中和性單克隆抗體和HIV-1感染陽性血清均敏感、中和特性強的假病毒，為候選疫苗的抗原選擇和優(yōu)化提供依據(jù)。
　　本課題根據(jù)已知的單抗識別表位、已報道的能增強病毒對單抗敏感性的位點和N-連接糖基化位點為依據(jù)，對S939 Env設計突變，通過環(huán)形誘變，DpnI酶篩選的方式得到突變體，酶切初步

3、鑒定，測序確定突變結果。將含有突變env的真核表達質粒與HIV-1骨架質粒pSG3△env共轉染293FT細胞，收集上清獲得假病毒，通過假病毒單輪感染TZM-bl細胞檢測假病毒滴度和突變位點對假病毒感染能力的影響。用HIV-1中和性單抗、HIV-1感染的陽性血清來檢測改造位點對假病毒中和特性的影響。
　　單抗2F5、4E10識別gp41近膜區(qū)（MPER）上的線性表位，在S939上對該表位進行聯(lián)合改造，改造后的假病毒FE相比原始株S

4、939感染力無顯著變化。FE對單抗2F5敏感性較S939提高11倍以上，對單抗4E10敏感性無明顯變化。在FE上進行單抗2G12表位的改造（I295N、N334S和D386N）獲得假病毒株FE-2G12，其感染力較FE略微增強。2G12表位的改造沒有使假病毒FE-2G12對單抗2G12敏感，反而降低了對單抗b12和部分陽性血清的敏感性。
　　在FE上進行了8個已報道的增強病毒中和活性位點的改造，其中6個位點的突變I309L、L66

5、9S、G458A、T569A、I675V和D180N顯著降低了病毒的感染力，因而不能進行其對病毒中和特性影響的評價。其余兩個突變中，S365A增強了病毒的感染力，F(xiàn)22L對病毒感染力無影響，這兩個突變均沒有增強病毒的中和活性。
　　以FE為模板，對25個N-連接的糖基化位點進行單獨刪除，共獲得25個含有單個糖基化刪除的Env表達質粒，并與pSG3△env質粒共轉染293FT細胞收獲假病毒。對這25個假病毒感染力的檢測發(fā)現(xiàn)，其中5個

6、分布在V1/V2，C1/C2區(qū)糖基化位點的刪除嚴重影響了病毒的感染力，含有這5個刪除位點的假病毒檢測不到其感染能力。分布在免疫反應靜默面（immunologically-silent face domains）V4、C4和V5區(qū)域中的糖基化位點的刪除（除了N392(V4)）對假病毒的感染性有一定的增強。其他糖基化位點的刪除均不同程度的減弱了假病毒的感染能力。在假病毒中和特性方面，糖基化位點N197(C2)，N301(V3)，N442(C

7、4)和N625（gp41）的刪除使假病毒對部分HIV-1陽性血清、抗CD4結合位點抗體b12和抗gp41抗體2F5和4E10更加敏感。N142(V1)的刪除使假病毒對單抗b12，2F5和4E10敏感性增強，但對HIV-1陽性血清敏感性沒有影響。N355(C3)和N463(V5)的刪除使假病毒對2F5和4E10敏感性增強。
　　根據(jù)前幾部分的改造結果，選擇其中能對病毒中和活性顯著增強的位點，結合V5（N463、N466）和C3（N3

8、39）區(qū)的糖基化位點以及與N442臨近的N448的刪除，在FE上按不同組合進行了聯(lián)合改造，共獲得了7株聯(lián)合突變假病毒，其中除197M-4外，均顯著降低了病毒的感染力。對其中6株假病毒的中和特性分析發(fā)現(xiàn)，相比于原始株S939、改造株FE以及單個糖基化位點的改造，聯(lián)合突變株對單抗2F5、4E10和b12，以及大部分陽性血清，均顯示出了很強的敏感性。
　　本實驗通過對55個氨基酸位點的突變改造，發(fā)現(xiàn)了一些能夠顯著影響病毒感染能力的位點，