中國B′-C亞型HIV-1感染者中和抗體水平與疾病進展關(guān)系的研究.pdf

1、目的:
　　 HIV-1感染機體后可以誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫。已有研究表明,利用HIV-1單克隆抗體(Mabs)被動免疫恒河猴后可以保護其免受致病性SHIV的攻擊,提示中和抗體在HIV-1感染過程中可能具有保護作用。然而,對于不同疾病進展階段HIV-1感染者中和抗體水平的研究結(jié)論并不一致。一些研究表明,HIV-1感染者體內(nèi)含有不同水平針對自體病毒、異體病毒和實驗室毒株的中和抗體,與疾病進展者相比,緩慢進展者(slow pro

2、gressor,SP)體內(nèi)含有較高水平針對自體病毒、異體病毒和實驗室毒株的中和抗體;針對自體病毒和異體病毒的中和抗體可以有效控制母嬰垂直傳播。以上均證明了中和抗體在控制HIV-1感染者疾病進展中發(fā)揮著重要的作用。而另一些研究表明,SP體內(nèi)沒有或含有較低水平針對自體和異體病毒的中和抗體,緩慢進展者和疾病進展者中和抗體水平?jīng)]有顯著性差異。在不同亞型HIV-1感染者之間,中和抗體的保護作用也存在差異。與B亞型HIV-1感染者相比,來自非洲地區(qū)

3、的C亞型HIV-1感染者血漿具有較強中和原代病毒的能力。因此,關(guān)于不同亞型HIV-1感染者針對自體和異體病毒中和抗體與疾病進展的關(guān)系還有待進一步研究。
　　 明確不同疾病進展階段HIV-1感染者針對自體病毒和異體病毒的中和抗體水平以及是否存在具有廣泛交叉中和作用抗體,將為HIV-1疫苗的設(shè)計提供理論依據(jù)。對于B和C亞型HIV-1感染者研究表明,大約有10％的HIV-1感染者體內(nèi)含有具有廣泛交叉作用的中和抗體,目前已從這些感染者體

4、內(nèi)分離到多種具有廣泛交叉作用的Mabs,如IgG1b12、2G12、447-52D、2F5、4E10,它們對多種原代病毒具有中和作用。因此,這些感染者成為研制有效疫苗的研究熱點。
　　 中國B'/C亞型HIV-1感染者占總感染人數(shù)的47％,多以吸毒途徑感染,且存在由高危人群向一般人群擴散的趨勢,是中國HIV-1的主要流行株之一。上述有關(guān)中和抗體的研究主要來自于歐美及非洲B和C亞型HIV-1感染者,且結(jié)果不盡相同。由于中國人免疫特

5、點不同于歐美及非洲人群,對于中國B'/C亞型HIV-1感染者不同疾病進展階段中和抗體水平少有報道,而對于廣泛交叉作用中和抗體的研究尚屬空白。
　　 本研究利用本實驗室分離的自體和異體原代分離株,采用外周血單個核細胞(PBMC)中和抗體實驗,測定中國B'/C亞型HIV-1感染者血漿對自體病毒、異體病毒的中和作用,篩選具有廣泛交叉作用的中和抗體,探討中國BYC亞型HIV-1感染者中和抗體水平以及中和抗體水平與疾病進展的關(guān)系,為我國臨

6、床抗HIV治療、疫苗設(shè)計提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、實驗對象
　　 研究對象來自云南、新疆、遼寧地區(qū),其HIV-1感染由中國醫(yī)科大學(xué)附屬一院艾滋病確認(rèn)實驗室根據(jù)《中華人民共和國HIV/AIDS診斷標(biāo)準(zhǔn)》用WB試驗確認(rèn)為陽性。樣品采集時間為2004年6月-2006年9月。用加有15％乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝劑的真空采血管抽取靜脈血10 ml,全血用于病毒分離,離心分離血漿-80℃凍存。
　　

7、 MT2細胞系、GHOST-CCR5及GHOST-CXCR4細胞系由中國CDC惠贈。
　　 2、CD4絕對值計數(shù)
　　 將20μl CD4/CD8/CD3 TriTEST試劑加入CD4絕對計數(shù)管中,加入50μl抗凝血,室溫避光15min,加入免洗溶血素450μl,室溫避光15min,FACS MEILTISET軟件檢測并進行自動分析,計算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴細胞絕對值及相應(yīng)比值。
　　 3、病毒載量

8、測定
　　 采用RT-PCR方法,按照羅氏公司HIV病毒載量測定說明書進行操作。病毒載量的最低檢出線為400 copies/ml。HIV-1感染者的病毒載量轉(zhuǎn)化為以10為底的對數(shù)用于統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 4、病毒分離
　　 采用微量全血法。用密度梯度離心法分離健康人PBMC,以含2.0μg/ml植物血凝素(PHA)的RPMI-1640(美國GIBCO公司)預(yù)刺激培養(yǎng)72h。在病毒分離24h前,將PBMC用20 U/

9、ml IL-2(美國羅氏公司)活化,于24孔板中備板。每孔加2ml含PBMC(濃度為1×106cells/ml)的1640(含10％胎牛血漿,1％L2-谷氨酰胺,2μg/ml聚凝胺,1％青-鏈霉素和20U/ml的IL-2)。將HIV-1感染者抗凝全血在24孔板上做25μl、50μl、100μl三個梯度稀釋,37℃,5％CO2培養(yǎng)。每3天換液,每7天加入新鮮預(yù)刺激72h的健康人PBMC。1周后,每3天測一次P24,直至30天。P24陽性的

10、上清收集凍存于-80℃冰箱中備用。
　　 5、TCID50檢測
　　 將PHA預(yù)刺激的健康人PBMC經(jīng)20U/ml IL-2活化后,調(diào)整濃度為4×106cells/ml。96孔板中每孔加入PBMC懸液50μl。每孔加入經(jīng)4倍稀釋至4-8的病毒懸液50μl,37℃5％CO2培養(yǎng)。第3天換液,第7天測p24。以Spearman-Karber方法計算TCID50。
　　 6、SI/NSI表型測定
　　 利用MT

11、-2細胞系進行合胞體誘導(dǎo)形成檢測。將MT-2細胞按2×105 cells/300μl/孔加入到48孔板上。用含100 TCID50病毒上清染毒,37℃,5％CO2培養(yǎng)14天。每2～3天倒置顯微鏡下觀察細胞病變(CPE)情況。以實驗室毒株SF33為陽性對照,Ba1為陰性對照。
　　 7、輔助受體利用實驗
　　 將GHOST細胞接種24孔板,每孔6×104 cells/0.5ml。第2天,細胞單層約70％分布,去掉培養(yǎng)基。取

12、100 TCID50病毒懸液進行染毒,37℃、5％CO2孵育2 h后,用PBS洗滌三遍,用2ml培養(yǎng)液重懸細胞進行培養(yǎng)。同時采用SF33和BaL-2作為陽性和陰性對照。3天后收獲病毒上清測定p24。
　　 8、亞型測定
　　 全血提取核酸,采用PCR對gag、pol區(qū)基因片斷進行擴增。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)提純后,在美國ABI公司的377型DNA全自動測序儀上進行序列測定和分析。測得的序列用Bioedit軟件進行編輯校正后,使用Wi

13、sconsin PackageGCG(Version10)軟件進行分析。以Pileup程序?qū)悠芳皣H標(biāo)準(zhǔn)序列進行排列和比較,其中國際標(biāo)準(zhǔn)參考序列從美國Los Alamos核酸序列庫網(wǎng)站下載,用Mega軟件的Neighbor-joining法繪制系統(tǒng)進化樹。
　　 9、中和抗體實驗
　　 56℃,30分鐘滅活HIV-1感染者和正常人血漿(NHP)。用正常人血漿對HIV-1感染者血漿進行倍比稀釋,2倍稀釋6次(從1/10～

14、1/320),每個稀釋度的血漿量是25μL。把稀釋后的血漿加入96孔板(3個平行孔)。在每孔中加入25μl含100TCID50病毒稀釋液,把培養(yǎng)板放入37℃孵育30min。加入50μl用1640培養(yǎng)液(含10％FBS、2％PS、1％L-glulamin)懸浮的PHA預(yù)刺激3天健康人PBMC,按每孔5×105 cells加入培養(yǎng)板中,培養(yǎng)16-18h,洗滌細胞3次,用200μl培養(yǎng)液重懸細胞,培養(yǎng)第4天換液,第7天測p24。以正常人血漿加

15、病毒懸液為對照孔。以抑制50％陰性孔p24濃度的血漿最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)計算中和抗體滴度。中和抗體滴度≥1:10為具有中和作用;中和抗體滴度＜1:10無中和作用。
　　 10、篩選廣泛交叉作用中和抗體(BCN)
　　 選擇基因同源性較低的3株原代病毒用于廣泛交叉中和抗體的篩選。用正常人血漿對HIV-1感染者血漿進行1:10倍稀釋。中和抗體試驗方法和判定標(biāo)準(zhǔn)同方法9。能夠同時對3個病毒發(fā)揮中和作用的HIV-1感染者定義為具有

16、廣泛交叉作用抗體(BCN);對3個病毒均不發(fā)揮中和作用的HIV-1感染者定義為非廣泛交叉作用抗體(Non-BCN)。將某個HIV-1感染者血漿能夠中和異體病毒的個數(shù)占3個異體病毒的百分率定義為HIV-1感染者中和異體病毒的寬度;將某個HIV-1感染者血漿中和3個異體病毒抗體滴度的幾何平均滴度定義為HIV-1感染者中和異體病毒的強度。
　　 11、廣泛交叉作用中和抗體(BCN)滴度測定
　　 經(jīng)篩選,可同時中和3株HIV-

17、1的18例血漿用于BCN中和抗體滴度測定。利用JL125、LN82、HA19、JL66、YN08、YN103、YN108、SF33、BaL等9個HIV-1(包括7個原代病毒和2個實驗室毒株)對18例BCN HIV-1感染者血漿進行中和抗體水平檢測,中和抗體實驗同方法9。隨機選擇8例Non-BCN HIV-1感染者血漿進行中和抗體滴度的測定。
　　 12、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 所有統(tǒng)計均采用SPSS15.0軟件非參數(shù)檢驗。不同

18、疾病進展階段患者之間中和抗體水平的差異用Mann-Whitney U檢驗;中和抗體與病毒載量的相關(guān)性分析采用Spearman檢驗。BCN與Non-BCN血漿對同一原代病毒中和抗體水平的比較采用Wilcoxon檢驗;不同疾病進展階段中和抗體發(fā)揮作用數(shù)量的比較采用x2檢驗。
　　 結(jié)果:
　　 1、不同時期血漿針對自體病毒中和作用與疾病進展的關(guān)系
　　 我們將從血液標(biāo)本中分離到的病毒設(shè)為V,病毒分離時采集的血漿標(biāo)本設(shè)

19、為P0:6個月后采集的血漿設(shè)為P6。在P0-V的中和抗體實驗中,從SP組分離到的原代分離株中,100％(3/3)可被P0中和作用,而HIV組中僅有19.04％(4/21)的原代分離株可被P0中和作用,中和抗體滴度與病毒載量無明顯相關(guān)性(P=0.110)。在P6-V的中和抗體試驗中,能夠被P0中和的7株原代分離株(SP組3株,HIV組4株)中和抗體水平明顯增高,HIV組中不能被P0中和的17株原代分離株中,有8株可以被P6中和,中和抗體滴

20、度與病毒載量呈顯著的負(fù)相關(guān)(r=-0.54,P=0.001)。在P0-V和P6-V中和抗體試驗中,SP組中和抗體滴度顯著高于HIV組(P=0.007,0.021)。
　　 2、不同疾病進展階段針對異體病毒中和抗體與疾病進展的關(guān)系
　　 結(jié)果顯示,HIV-1慢性感染組與AIDS組之間中和異體病毒的寬度和強度存在顯著性差異,HIV-1慢性感染組顯著高于AIDS組(P=0.011)。HIV-1慢性感染組中和異體病毒的寬度和強度

21、與病毒載量呈正相關(guān)(r=0.400,P=0.002),而AIDS組中和異體病毒的寬度和強度與病毒載量沒有顯著的相關(guān)性。HIV-1慢性感染組和AIDS組中和異體病毒的寬度和強度與CD4T淋巴細胞數(shù)均沒有顯著的相關(guān)性(P=0.423,0.701)。
　　 3、廣泛交叉中和抗體(BCN)的篩選和滴度測定
　　 117例B'/C亞型HIV-1感染者中,有15.4％(18/117)的HIV-1感染者可以中和所有的3株原代病毒,有7

22、4.4％(87/117)的HIV-1感染者至少可以中和1株以上的病毒。我們根據(jù)有無AIDS指征性疾病和CD4T淋巴細胞數(shù)將HIV-1感染者分為HIV慢性感染組和AIDS組,在BCN存在的數(shù)量上,HIV慢性感染組組明顯高于AIDS組(P=0.046)。
　　 18例BCN HIV-1感染者中,有13例HIV-1感染者可以同時中和9株HIV-1,其余5例可以中和8株HIV-1。隨機抽取的8例Non-BCN HIV-1感染者中,只能中

23、和7株HIV-1原代病毒中的1-2株,所有Non-BCN對實驗室毒株(SF33、BaL)均具有中和作用。BCN(n=18)與Non-BCN(n=8)HIV-1感染者對9株HIV-1(包括原代毒株和實驗室毒株)在中和抗體滴度和中和病毒數(shù)量上均存在顯著性差異(P=0.008)。
　　 結(jié)論:
　　 1、中國B'/C亞型HIV-1感染者緩慢進展者組均含有較高水平針對自體病毒的中和抗體,6個月后中和抗體水平明顯增高,HIV組感染

24、者體內(nèi)無或有較低水平針對自體病毒的中和抗體,6個月后中和抗體水平僅部分增高,提示針對自體病毒的中和抗體與疾病進展相關(guān);針對自體病毒的中和抗體滴度與病毒載量呈負(fù)相關(guān),提示中和抗體可能在控制HIV-1復(fù)制方面起重要作用。
　　 2、中國B'/C亞型HIV-1感染者不同疾病進展階段針對異體病毒中和作用能力不同,HIV慢性感染組顯著高于AIDS組,當(dāng)疾病進展到AIDS期時,失去對異體病毒的中和作用,提示針對異體病毒的中和抗體與疾病進程有