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文檔簡介
1、研究背景與目的:微管是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要成分,存在于所有的真核細(xì)胞中,與其他蛋白共同組裝成紡錘體、中心粒、鞭毛、神經(jīng)管等多種結(jié)構(gòu)。正常條件下,微管的聚合和解聚保持著動(dòng)態(tài)平衡,因此細(xì)胞分裂高度可控,進(jìn)展有序。這種不穩(wěn)定的動(dòng)力學(xué)特性使得微管在維持細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞有絲分裂、胞內(nèi)物質(zhì)的輸送及信號(hào)傳導(dǎo)等細(xì)胞關(guān)鍵生物學(xué)過程中具有重要調(diào)節(jié)功能。微管在細(xì)胞分裂前期聚合成為紡錘體,而紡錘體在細(xì)胞有絲分裂過程中牽引染色體向兩極移動(dòng)進(jìn)入至兩個(gè)子細(xì)胞中
2、,從而完成細(xì)胞增殖。由于微管在細(xì)胞有絲分裂過程中承擔(dān)的重要作用,微管蛋白逐漸成為醫(yī)藥工作者研究與開發(fā)抗癌藥物的重要靶點(diǎn)之一,而以微管蛋白為靶點(diǎn)的微管蛋白抑制劑也已成為臨床證實(shí)有效的抗腫瘤藥物。該類抑制劑的作用機(jī)制是在快速分裂的腫瘤細(xì)胞中,通過抑制微管蛋白的聚合或者促進(jìn)微管蛋白的聚合而干擾細(xì)胞的有絲分裂過程,使細(xì)胞有絲分裂中斷,停滯于M期,從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,發(fā)揮抗腫瘤作用。
根據(jù)作用機(jī)制的不同,微管蛋白抑制劑可分為兩
3、大類:①抑制微管蛋白聚合的微管蛋白解聚劑,如秋水仙堿類和長春堿類化合物;②促進(jìn)微管蛋白聚合的微管蛋白聚合劑,如紫杉醇及其類似物,埃博霉素及其類似物。根據(jù)微管蛋白抑制劑在微管蛋白上的作用位點(diǎn)的不同,微管蛋白抑制劑又可分為3種類型:①作用于秋水仙堿位點(diǎn)的微管蛋白抑制劑;②作用于長春堿位點(diǎn)的微管蛋白抑制劑;③作用于紫杉醇位點(diǎn)的微管蛋白抑制劑。目前,長春堿和紫杉醇位點(diǎn)微管蛋白抑制劑類藥物已在腫瘤臨床治療方面占據(jù)了重要地位,紫杉醇更是已成為肺癌、
4、乳腺癌和卵巢癌的重要一線治療藥物。然而,和其他抗腫瘤藥物一樣,難以耐受的副作用及用藥后耐藥性的出現(xiàn)限制了微管蛋白抑制劑的臨床使用。因此,開發(fā)新型的具有更強(qiáng)活性、更低毒性、并且對(duì)多藥耐藥腫瘤細(xì)胞更有效的新型微管蛋白抑制劑具有很大的應(yīng)用前景。
HA14-1是本博士論文作者的導(dǎo)師之一Ziwei Huang教授等研發(fā)的小分子化合物,是世界上第一例報(bào)道的Bcl-2抑制劑,能夠強(qiáng)有力地誘導(dǎo)乳腺、結(jié)直腸癌、腎癌、宮頸癌、腦膠質(zhì)瘤、白血病
5、等多種腫瘤細(xì)胞系發(fā)生凋亡。在后續(xù)的研究中,我們發(fā)現(xiàn)HA14-1不僅能夠通過誘導(dǎo)活性氧(ROS)產(chǎn)生、細(xì)胞色素C釋放、半胱天冬酶Caspase-9/-3活化這一信號(hào)途徑而誘導(dǎo)凋亡,在其藥物濃度大于10μM時(shí),還可以作用于微管蛋白秋水仙堿位點(diǎn)抑制微管蛋白聚合。將HA14-1作為母體藥物對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改構(gòu),設(shè)計(jì)并合成了一系列新型HA14-1類似物(2-amino-4-phenyl-4H-chromene-3-carboxylate analog
6、s),命名為mHA1-19,并對(duì)其中抗腫瘤活性較強(qiáng)的mHA1,6,11進(jìn)行了后續(xù)的生物學(xué)評(píng)價(jià)和抗腫瘤機(jī)制研究。這些新型化合物表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗腫瘤活性和更好的穩(wěn)定性。腫瘤細(xì)胞在接受藥物處理后逐漸出現(xiàn)包括細(xì)胞變長、不對(duì)稱及出現(xiàn)長偽足等細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,與HA14-1處理細(xì)胞后迅速表現(xiàn)出細(xì)胞縮小、核固縮、凋亡小體出現(xiàn)等細(xì)胞凋亡的典型改變截然不同。這些現(xiàn)象均提示這一系列HA14-1類似物有著不同于母體藥物HA14-1的腫瘤細(xì)胞殺傷機(jī)制,維持細(xì)胞正常
7、形態(tài)的微管蛋白極有可能是其主要作用靶點(diǎn)。雖然秋水仙堿類藥物因?yàn)槎拘暂^大目前還暫未用于腫瘤治療,但秋水仙堿位點(diǎn)作為一個(gè)很有前景的腫瘤藥物靶標(biāo)一直備受關(guān)注,目前已有多個(gè)化合物進(jìn)入了臨床研究。研究及闡明這一系列mHA類似物的作用靶點(diǎn)及其抗腫瘤機(jī)制,將推動(dòng)新型、高效的秋水仙堿位點(diǎn)抑制劑的設(shè)計(jì)和開發(fā),具有重要意義。
方法:
1.化合物合成:該系列化合物總的合成路徑為采用苯甲醛、酚類似物和氰乙酸乙酯這三種組分和哌啶進(jìn)行一
8、步化反應(yīng)合成?;衔锖铣珊缶?jīng)過核磁共振氫譜和質(zhì)譜驗(yàn)證。
(1)mHA1的制備3-溴-4,5-二甲氧基苯甲醛(0.49g,0.002mol)、3-二甲氨基苯酚(0.27g,0.002mol)、氰乙酸乙酯(0.21 mL,0.002 mol)和哌啶(0.4 mL,0.004 mol)溶于15ml無水乙醇,室溫下攪拌4小時(shí)。加入80ml二氯甲烷稀釋后用水清洗,硫酸鈉干燥化合物,過濾除去硫酸鈉,蒸發(fā)干燥溶劑。使用色譜分析法(己烷
9、/二氯甲烷)提純粗制品,得到0.6g mHA1,收益率63%。
(2)mHA6的制備采用3-溴-4,5-二甲氧基苯甲醛、1-萘酚和氰乙酸乙酯作為原料,后續(xù)步驟同上,得到0.45g mHA6,收益率46%。
(3)mHA11的制備采用3-氯苯甲醛、3-二甲氨基苯酚和氰乙酸乙酯作為原料,后續(xù)步驟同上,得到0.32g mHA11,收益率43%。
2.細(xì)胞培養(yǎng):人白血病細(xì)胞HL-60/Bcl-2(pZi
10、p-Bcl-2質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染)惠贈(zèng)于Dr.Kapil N.Bhalla(邁阿密大學(xué)醫(yī)學(xué)院,佛羅里達(dá)州,美國)。細(xì)胞培養(yǎng)條件為RPMI1640培養(yǎng)基,10%胎牛血清,2mM谷氨酰胺,100U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素,5%二氧化碳,37℃。
3.小鼠骨髓細(xì)胞收集小鼠骨髓細(xì)胞樣本來采樣于年齡為3月的C57BL/6雌性小鼠(Charles RiverLabs)。CO2吸入法處死小鼠,分離取出小鼠的脛骨和股骨,注射器吸取R
11、PMI1640培養(yǎng)基反復(fù)沖洗脛骨和股骨,將骨腔內(nèi)骨髓細(xì)胞沖洗出來,采用淋巴細(xì)胞分離法獲得小鼠骨髓細(xì)胞,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔1×105細(xì)胞。
4.人正常骨髓細(xì)胞樣本收集在通過倫理委員會(huì)審查及獲得患者知情同意后,取得3例人正常骨髓細(xì)胞樣本。樣本均來自彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者,已通過病理證實(shí)為正常骨髓。按骨髓穿刺術(shù)操作規(guī)范進(jìn)行操作取得人體骨髓樣本,將肝素化的骨髓細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋后,采用淋巴細(xì)胞分離法獲得
12、人體骨髓細(xì)胞,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔1×105細(xì)胞。
5.CellTiter-Blue法測(cè)定細(xì)胞活力HL-60/Bcl-2細(xì)胞或小鼠骨髓細(xì)胞接種于96孔板,分別接受不同濃度的mHAs藥物處理,溫箱孵育72小時(shí)后,采用CellTiter-Blue細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒按照使用說明測(cè)定細(xì)胞活力。
6.Cell Count Kit-8(CCK-8)法測(cè)定細(xì)胞活力人骨髓細(xì)胞接種于96孔板,24小時(shí)后分別接受不同濃
13、度的mHAs藥物處理,溫箱孵育72小時(shí)后,采用CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞活力。
7.細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)細(xì)胞接受不同濃度的mHAs藥物及DMSO對(duì)照處理24小時(shí)后,收集細(xì)胞,新鮮培養(yǎng)基稀釋后與甲基纖維素半固體培養(yǎng)基混合均勻,接入培養(yǎng)皿使每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞數(shù)目為200,體積為2ml。37℃,5%二氧化碳及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育10-14天后倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)并計(jì)算細(xì)胞克隆形成率。
8.細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)
14、1μM mHAs處理細(xì)胞24小時(shí),倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變并拍照。
9.計(jì)算機(jī)分子模型采用微管和DAMA-秋水仙堿復(fù)合物中的微管晶體結(jié)構(gòu)(PDB:1SA0)作為模板,采用Autodock4程序來預(yù)測(cè)微管與配體mHA1,6,11的結(jié)合模型。
10.秋水仙堿-微管蛋白競爭結(jié)合試驗(yàn)1μM放射性標(biāo)記的[3H]秋水仙堿,1% DMSO和不同濃度的待測(cè)藥物均溶于50μl G-PEM緩沖液中,與1μM微管蛋白共同孵育1
15、小時(shí),經(jīng)DEAE-纖維素柱層析,采用液體閃爍法(Perkin-Elmer)測(cè)定濾液中放射性強(qiáng)度。使用GraphPadPrism對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸分析。
11.微管蛋白聚合實(shí)驗(yàn)按照試劑盒生產(chǎn)公司提供的說明書進(jìn)行,將微管蛋白溶于G-PEM緩沖液中,得到濃度為3mg/ml的微管蛋白溶液,加入預(yù)先加入50μl待測(cè)藥物溶液的96孔板內(nèi),50μl/孔,使用Synergy2酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(360nm/420nm),每分鐘一次,共測(cè)定
16、1小時(shí)。
12.免疫熒光染色人肺癌細(xì)胞CRL5908經(jīng)1μM mHA1,6,11處理24h后,4%多聚甲醛4℃固定30分鐘,0.1% Triton X-100透膜處理15min,2% BSA封閉處理30min,1∶2000抗-α-微管蛋白單克隆抗體和7∶1000羅丹明-鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的抗肌動(dòng)蛋白抗體避光處理細(xì)胞1h,1∶200抗鼠IgG二抗避光處理30min,1μg/ml DAPI處理1min。免疫熒光顯微鏡下觀察和拍照。<
17、br> 13.細(xì)胞周期測(cè)定1×106 HL-60/Bcl-2細(xì)胞分別接受1,3,5μM mHAs藥物處理24h。收集細(xì)胞,PBS清洗2次,重懸于100μl PBS和1ml75%預(yù)冷乙醇內(nèi),-20℃過夜保存。測(cè)定當(dāng)天離心細(xì)胞,移去上清,加入500μl PI染色液(含80μg/mL碘化丙啶,100μg/mL核糖核酸酶A,1%曲拉通),避光孵育至少半小時(shí)后流式細(xì)胞儀檢測(cè),F(xiàn)lowJo7.5軟件分析。
14.DNA碎片分析方
18、法測(cè)定細(xì)胞凋亡1×106 HL-60/Bcl-2細(xì)胞分別接受不同藥物處理:DMSO對(duì)照、陽性對(duì)照0.1μM和1μM秋水仙堿,1μM和5μM mHA1,6,11,溫箱孵育24h,按照試劑盒生產(chǎn)公司提供的說明書進(jìn)行提取每個(gè)處理組DNA,DNA經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,EB顯色照相。
結(jié)果:
1.mHA系列化合物細(xì)胞毒性測(cè)定:測(cè)定mHA1-19對(duì)人白血病細(xì)胞HL-60/Bcl-2的細(xì)胞毒性并計(jì)算其IC50,結(jié)果顯示該系
19、列化合物中mHA1,6,11具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性,選擇這3種化合物進(jìn)行后續(xù)的生物學(xué)評(píng)價(jià)和抗腫瘤機(jī)制研究。
2.mHA系列化合物構(gòu)效分析:對(duì)該系列化合物進(jìn)行構(gòu)效分析,發(fā)現(xiàn)C6位點(diǎn)上連接二甲氨基與苯基對(duì)化合物活性的影響類似但優(yōu)于羥基,羥基優(yōu)于氨基;mHA7,15,17活性均很差,提示C7位點(diǎn)添加任何基團(tuán)均會(huì)降低化合物的活性。
3.mHA1,6,11抗腫瘤活性明顯強(qiáng)于其母體藥物HA14-1:分別用不同濃度的HA14
20、-1和mHA1,6,11處理人白血病HL-60/Bcl-2細(xì)胞,24h或72h后測(cè)定細(xì)胞活力,結(jié)果顯示mHA1,6,11的IC50均小于1μM,而HA14-1的IC50為9.394±0.18μM,mHA1,6,11抗腫瘤活性明顯強(qiáng)于其母體藥物HA14-1。
4.mHA1,6,11對(duì)人白血病細(xì)胞具有較強(qiáng)細(xì)胞毒性,但對(duì)正常小鼠骨髓細(xì)胞毒性較低:分別對(duì)人白血病HL-60/Bcl-2細(xì)胞及正常小鼠骨髓細(xì)胞進(jìn)行相同濃度的mHA1,6
21、,11藥物處理,72h后分別測(cè)定細(xì)胞活力。結(jié)果顯示1μM mHA1,6,11可以殺死約一半的腫瘤細(xì)胞,而1μM藥物處理對(duì)正常小鼠骨髓細(xì)胞幾乎無影響。
5.mHA1,6,11對(duì)人正常骨髓細(xì)胞幾乎無毒性:采集人正常骨髓細(xì)胞進(jìn)行不同濃度的mHA1,6,11藥物處理,72h后分別測(cè)定細(xì)胞活力。結(jié)果顯示3μM mHAs可殺死幾乎全部的惡性HL-60/Bcl-2細(xì)胞,而同樣處理對(duì)人正常骨髓細(xì)胞幾乎毫無影響。
6.陽性對(duì)照
22、藥物秋水仙堿對(duì)正常小鼠骨髓細(xì)胞毒性較大:采用秋水仙堿位點(diǎn)代表藥物秋水仙堿作為陽性對(duì)照,對(duì)人白血病HL-60/Bcl-2細(xì)胞及正常小鼠骨髓細(xì)胞進(jìn)行相同濃度藥物處理,72h后分別測(cè)定細(xì)胞活力,結(jié)果顯示秋水仙堿對(duì)腫瘤細(xì)胞及正常骨髓細(xì)胞均有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性,盡管其IC50值在人白血病細(xì)胞中僅為33.5±3.5 nM,但藥物濃度在25nM時(shí)即可殺傷約30%的正常骨髓細(xì)胞。
7.mHA1,6,11可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞喪失克隆形成能力:人白血病
23、HL-60/Bcl-2細(xì)胞在接受藥物處理后培養(yǎng)10~14d后計(jì)數(shù)克隆形成數(shù),計(jì)算所得IC50值低于細(xì)胞毒性試驗(yàn),提示藥物處理不僅能在72h內(nèi)迅速殺死腫瘤細(xì)胞,并可引起部分細(xì)胞喪失增殖能力及克隆形成能力。
8.mHA1,6,11引起腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特殊形態(tài)改變:mHA1,6,11可引起腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特殊形態(tài)改變。人白血病HL-60/Bcl-2細(xì)胞由懸浮細(xì)胞典型的球體變?yōu)椴灰?guī)則形、細(xì)胞變長及出現(xiàn)長偽足;人肺癌CRL5908細(xì)胞則由貼
24、壁細(xì)胞典型的梭狀變?yōu)槎噙呅位蝾悎A形。
9.計(jì)算機(jī)模擬對(duì)接研究顯示mHA1,6,11可結(jié)合于微管蛋白上的秋水仙堿位點(diǎn):計(jì)算機(jī)模擬對(duì)接研究采用DAMA-秋水仙堿晶體結(jié)構(gòu)作為模板,模擬計(jì)算結(jié)果顯示mHA1,6,11與秋水仙堿均可結(jié)合于微管蛋白上的相同位點(diǎn)-秋水仙堿位點(diǎn),mHA1,6和秋水仙堿結(jié)合模式相似而mHA11結(jié)合模式略有不同。
10.秋水仙堿-微管蛋白競爭結(jié)合試驗(yàn)證實(shí)了mHA1,6,11可與秋水仙堿競爭結(jié)合位
25、點(diǎn):秋水仙堿-微管蛋白競爭結(jié)合試驗(yàn)顯示mHA1,6,11可與放射性標(biāo)記的秋水仙堿競爭結(jié)合位點(diǎn),抑制其與微管蛋白結(jié)合,其作用呈劑量依賴性方式。
11.微管蛋白聚合實(shí)驗(yàn)顯示mHA1,6,11和秋水仙堿均可抑制微管蛋白聚合,紫杉醇可促進(jìn)微管蛋白聚合:微管蛋白聚合實(shí)驗(yàn)顯示紫杉醇可促進(jìn)微管蛋白聚合,mHA1,6,11和秋水仙堿均可抑制微管蛋白聚合,證實(shí)mHA1,6,11具有強(qiáng)效的抗微管聚合作用。
12.免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)
26、證實(shí)mHA1,6,11可降低細(xì)胞內(nèi)微管含量并破壞其網(wǎng)狀分布:人肺癌CRL5908細(xì)胞接受1μM mHA1,6,11處理24h后行免疫熒光檢測(cè),顯示胞漿內(nèi)沿細(xì)胞長軸密集分布的微管變?yōu)閺浬⒎植?,且熒光?qiáng)度明顯降低,提示細(xì)胞內(nèi)微管含量減少。
13.mHA1,6,11可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生G2/M細(xì)胞周期阻滯:人白血病HL-60/Bcl-2細(xì)胞在接受1μM mHA1,6,11藥物處理24h后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)細(xì)胞發(fā)生特異性G2/M細(xì)
27、胞周期阻滯。
14.DNA碎片分析證實(shí)mHA1,6,11可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡:mHA1,6,11及秋水仙堿處理人白血病HL-60/Bcl-2細(xì)胞24h后行DNA碎片分析,出現(xiàn)明顯的凋亡條帶,證實(shí)秋水仙堿及mHA1,6,11均可誘導(dǎo)人白血病HL-60/Bcl-2細(xì)胞發(fā)生凋亡。
結(jié)論:
1.本研究獲得了一系列HA14-1類似物并證實(shí)其為具有高效抗腫瘤活性的微管蛋白抑制劑。
2.對(duì)該系
28、列化合物的構(gòu)效分析發(fā)現(xiàn)C6位點(diǎn)上連接二甲氨基與苯基類似但均優(yōu)于羥基,羥基優(yōu)于氨基;C7位點(diǎn)上不宜連接任何側(cè)鏈,為日后繼續(xù)研發(fā)新型微管蛋白抑制劑提供了設(shè)計(jì)思路。
3.本研究結(jié)果證明了mHA1,6,11具有較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞殺傷作用,其IC50為納摩爾級(jí)別,大大優(yōu)于其母體藥物HA14-1,而且對(duì)正常細(xì)胞毒性較小,具有進(jìn)一步研發(fā)成藥的可能性。
4.計(jì)算機(jī)模擬對(duì)接研究及秋水仙堿-微管蛋白競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)mHA1,6,11
29、均結(jié)合于微管蛋白上的秋水仙堿位點(diǎn)并可與秋水仙堿競爭結(jié)合位點(diǎn),為作用于秋水仙堿位點(diǎn)的新型微管蛋白抑制劑。
5.微管蛋白聚合實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)mHA1,6,11與紫杉醇作用方式相反,與秋水仙堿作用方式一致,為促微管蛋白解聚劑。
6.免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)顯示mHA1,6,11可降低細(xì)胞內(nèi)微管數(shù)量及破壞胞漿內(nèi)正常微管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
7.流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期檢測(cè)及DNA碎片分析實(shí)驗(yàn)證實(shí)mHA1,6,11通過阻滯腫瘤細(xì)胞
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