新型微管蛋白抑制劑的研發(fā)和抗腫瘤機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的:微管是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要成分，存在于所有的真核細(xì)胞中，與其他蛋白共同組裝成紡錘體、中心粒、鞭毛、神經(jīng)管等多種結(jié)構(gòu)。正常條件下，微管的聚合和解聚保持著動(dòng)態(tài)平衡，因此細(xì)胞分裂高度可控，進(jìn)展有序。這種不穩(wěn)定的動(dòng)力學(xué)特性使得微管在維持細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞有絲分裂、胞內(nèi)物質(zhì)的輸送及信號(hào)傳導(dǎo)等細(xì)胞關(guān)鍵生物學(xué)過程中具有重要調(diào)節(jié)功能。微管在細(xì)胞分裂前期聚合成為紡錘體，而紡錘體在細(xì)胞有絲分裂過程中牽引染色體向兩極移動(dòng)進(jìn)入至兩個(gè)子細(xì)胞中

2、，從而完成細(xì)胞增殖。由于微管在細(xì)胞有絲分裂過程中承擔(dān)的重要作用，微管蛋白逐漸成為醫(yī)藥工作者研究與開發(fā)抗癌藥物的重要靶點(diǎn)之一，而以微管蛋白為靶點(diǎn)的微管蛋白抑制劑也已成為臨床證實(shí)有效的抗腫瘤藥物。該類抑制劑的作用機(jī)制是在快速分裂的腫瘤細(xì)胞中，通過抑制微管蛋白的聚合或者促進(jìn)微管蛋白的聚合而干擾細(xì)胞的有絲分裂過程，使細(xì)胞有絲分裂中斷，停滯于M期，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。
　　 根據(jù)作用機(jī)制的不同，微管蛋白抑制劑可分為兩

3、大類:①抑制微管蛋白聚合的微管蛋白解聚劑，如秋水仙堿類和長春堿類化合物;②促進(jìn)微管蛋白聚合的微管蛋白聚合劑，如紫杉醇及其類似物，埃博霉素及其類似物。根據(jù)微管蛋白抑制劑在微管蛋白上的作用位點(diǎn)的不同，微管蛋白抑制劑又可分為3種類型:①作用于秋水仙堿位點(diǎn)的微管蛋白抑制劑;②作用于長春堿位點(diǎn)的微管蛋白抑制劑;③作用于紫杉醇位點(diǎn)的微管蛋白抑制劑。目前，長春堿和紫杉醇位點(diǎn)微管蛋白抑制劑類藥物已在腫瘤臨床治療方面占據(jù)了重要地位，紫杉醇更是已成為肺癌、

4、乳腺癌和卵巢癌的重要一線治療藥物。然而，和其他抗腫瘤藥物一樣，難以耐受的副作用及用藥后耐藥性的出現(xiàn)限制了微管蛋白抑制劑的臨床使用。因此，開發(fā)新型的具有更強(qiáng)活性、更低毒性、并且對(duì)多藥耐藥腫瘤細(xì)胞更有效的新型微管蛋白抑制劑具有很大的應(yīng)用前景。
　　 HA14-1是本博士論文作者的導(dǎo)師之一Ziwei Huang教授等研發(fā)的小分子化合物，是世界上第一例報(bào)道的Bcl-2抑制劑，能夠強(qiáng)有力地誘導(dǎo)乳腺、結(jié)直腸癌、腎癌、宮頸癌、腦膠質(zhì)瘤、白血病

5、等多種腫瘤細(xì)胞系發(fā)生凋亡。在后續(xù)的研究中，我們發(fā)現(xiàn)HA14-1不僅能夠通過誘導(dǎo)活性氧(ROS)產(chǎn)生、細(xì)胞色素C釋放、半胱天冬酶Caspase-9/-3活化這一信號(hào)途徑而誘導(dǎo)凋亡，在其藥物濃度大于10μM時(shí)，還可以作用于微管蛋白秋水仙堿位點(diǎn)抑制微管蛋白聚合。將HA14-1作為母體藥物對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改構(gòu)，設(shè)計(jì)并合成了一系列新型HA14-1類似物（2-amino-4-phenyl-4H-chromene-3-carboxylate analog

6、s），命名為mHA1-19，并對(duì)其中抗腫瘤活性較強(qiáng)的mHA1，6，11進(jìn)行了后續(xù)的生物學(xué)評(píng)價(jià)和抗腫瘤機(jī)制研究。這些新型化合物表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗腫瘤活性和更好的穩(wěn)定性。腫瘤細(xì)胞在接受藥物處理后逐漸出現(xiàn)包括細(xì)胞變長、不對(duì)稱及出現(xiàn)長偽足等細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，與HA14-1處理細(xì)胞后迅速表現(xiàn)出細(xì)胞縮小、核固縮、凋亡小體出現(xiàn)等細(xì)胞凋亡的典型改變截然不同。這些現(xiàn)象均提示這一系列HA14-1類似物有著不同于母體藥物HA14-1的腫瘤細(xì)胞殺傷機(jī)制，維持細(xì)胞正常

7、形態(tài)的微管蛋白極有可能是其主要作用靶點(diǎn)。雖然秋水仙堿類藥物因?yàn)槎拘暂^大目前還暫未用于腫瘤治療，但秋水仙堿位點(diǎn)作為一個(gè)很有前景的腫瘤藥物靶標(biāo)一直備受關(guān)注，目前已有多個(gè)化合物進(jìn)入了臨床研究。研究及闡明這一系列mHA類似物的作用靶點(diǎn)及其抗腫瘤機(jī)制，將推動(dòng)新型、高效的秋水仙堿位點(diǎn)抑制劑的設(shè)計(jì)和開發(fā)，具有重要意義。
　　 方法:
　　 1.化合物合成:該系列化合物總的合成路徑為采用苯甲醛、酚類似物和氰乙酸乙酯這三種組分和哌啶進(jìn)行一

8、步化反應(yīng)合成?；衔锖铣珊缶?jīng)過核磁共振氫譜和質(zhì)譜驗(yàn)證。
　　 (1)mHA1的制備3-溴-4，5-二甲氧基苯甲醛(0.49g，0.002mol)、3-二甲氨基苯酚(0.27g，0.002mol)、氰乙酸乙酯(0.21 mL，0.002 mol)和哌啶(0.4 mL，0.004 mol)溶于15ml無水乙醇，室溫下攪拌4小時(shí)。加入80ml二氯甲烷稀釋后用水清洗，硫酸鈉干燥化合物，過濾除去硫酸鈉，蒸發(fā)干燥溶劑。使用色譜分析法（己烷

9、/二氯甲烷）提純粗制品，得到0.6g mHA1，收益率63％。
　　 (2)mHA6的制備采用3-溴-4，5-二甲氧基苯甲醛、1-萘酚和氰乙酸乙酯作為原料，后續(xù)步驟同上，得到0.45g mHA6，收益率46％。
　　 (3)mHA11的制備采用3-氯苯甲醛、3-二甲氨基苯酚和氰乙酸乙酯作為原料，后續(xù)步驟同上，得到0.32g mHA11，收益率43％。
　　 2.細(xì)胞培養(yǎng):人白血病細(xì)胞HL-60/Bcl-2（pZi

10、p-Bcl-2質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染）惠贈(zèng)于Dr.Kapil N.Bhalla（邁阿密大學(xué)醫(yī)學(xué)院，佛羅里達(dá)州，美國）。細(xì)胞培養(yǎng)條件為RPMI1640培養(yǎng)基，10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，5％二氧化碳，37℃。
　　 3.小鼠骨髓細(xì)胞收集小鼠骨髓細(xì)胞樣本來采樣于年齡為3月的C57BL/6雌性小鼠(Charles RiverLabs)。CO2吸入法處死小鼠，分離取出小鼠的脛骨和股骨，注射器吸取R

11、PMI1640培養(yǎng)基反復(fù)沖洗脛骨和股骨，將骨腔內(nèi)骨髓細(xì)胞沖洗出來，采用淋巴細(xì)胞分離法獲得小鼠骨髓細(xì)胞，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1×105細(xì)胞。
　　 4.人正常骨髓細(xì)胞樣本收集在通過倫理委員會(huì)審查及獲得患者知情同意后，取得3例人正常骨髓細(xì)胞樣本。樣本均來自彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者，已通過病理證實(shí)為正常骨髓。按骨髓穿刺術(shù)操作規(guī)范進(jìn)行操作取得人體骨髓樣本，將肝素化的骨髓細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋后，采用淋巴細(xì)胞分離法獲得

12、人體骨髓細(xì)胞，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1×105細(xì)胞。
　　 5.CellTiter-Blue法測(cè)定細(xì)胞活力HL-60/Bcl-2細(xì)胞或小鼠骨髓細(xì)胞接種于96孔板，分別接受不同濃度的mHAs藥物處理，溫箱孵育72小時(shí)后，采用CellTiter-Blue細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒按照使用說明測(cè)定細(xì)胞活力。
　　 6.Cell Count Kit-8(CCK-8)法測(cè)定細(xì)胞活力人骨髓細(xì)胞接種于96孔板，24小時(shí)后分別接受不同濃

13、度的mHAs藥物處理，溫箱孵育72小時(shí)后，采用CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞活力。
　　 7.細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)細(xì)胞接受不同濃度的mHAs藥物及DMSO對(duì)照處理24小時(shí)后，收集細(xì)胞，新鮮培養(yǎng)基稀釋后與甲基纖維素半固體培養(yǎng)基混合均勻，接入培養(yǎng)皿使每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞數(shù)目為200，體積為2ml。37℃，5％二氧化碳及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育10-14天后倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)并計(jì)算細(xì)胞克隆形成率。
　　 8.細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)

14、1μM mHAs處理細(xì)胞24小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變并拍照。
　　 9.計(jì)算機(jī)分子模型采用微管和DAMA-秋水仙堿復(fù)合物中的微管晶體結(jié)構(gòu)(PDB:1SA0)作為模板，采用Autodock4程序來預(yù)測(cè)微管與配體mHA1，6，11的結(jié)合模型。
　　 10.秋水仙堿-微管蛋白競爭結(jié)合試驗(yàn)1μM放射性標(biāo)記的[3H]秋水仙堿，1％ DMSO和不同濃度的待測(cè)藥物均溶于50μl G-PEM緩沖液中，與1μM微管蛋白共同孵育1

15、小時(shí)，經(jīng)DEAE-纖維素柱層析，采用液體閃爍法(Perkin-Elmer)測(cè)定濾液中放射性強(qiáng)度。使用GraphPadPrism對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸分析。
　　 11.微管蛋白聚合實(shí)驗(yàn)按照試劑盒生產(chǎn)公司提供的說明書進(jìn)行，將微管蛋白溶于G-PEM緩沖液中，得到濃度為3mg/ml的微管蛋白溶液，加入預(yù)先加入50μl待測(cè)藥物溶液的96孔板內(nèi)，50μl/孔，使用Synergy2酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(360nm/420nm)，每分鐘一次，共測(cè)定

16、1小時(shí)。
　　 12.免疫熒光染色人肺癌細(xì)胞CRL5908經(jīng)1μM mHA1，6，11處理24h后，4％多聚甲醛4℃固定30分鐘，0.1％ Triton X-100透膜處理15min，2％ BSA封閉處理30min，1∶2000抗-α-微管蛋白單克隆抗體和7∶1000羅丹明-鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的抗肌動(dòng)蛋白抗體避光處理細(xì)胞1h，1∶200抗鼠IgG二抗避光處理30min，1μg/ml DAPI處理1min。免疫熒光顯微鏡下觀察和拍照。<

17、br>　　 13.細(xì)胞周期測(cè)定1×106 HL-60/Bcl-2細(xì)胞分別接受1，3，5μM mHAs藥物處理24h。收集細(xì)胞，PBS清洗2次，重懸于100μl PBS和1ml75％預(yù)冷乙醇內(nèi)，-20℃過夜保存。測(cè)定當(dāng)天離心細(xì)胞，移去上清，加入500μl PI染色液（含80μg/mL碘化丙啶，100μg/mL核糖核酸酶A，1％曲拉通），避光孵育至少半小時(shí)后流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)lowJo7.5軟件分析。
　　 14.DNA碎片分析方

18、法測(cè)定細(xì)胞凋亡1×106 HL-60/Bcl-2細(xì)胞分別接受不同藥物處理:DMSO對(duì)照、陽性對(duì)照0.1μM和1μM秋水仙堿，1μM和5μM mHA1，6，11，溫箱孵育24h，按照試劑盒生產(chǎn)公司提供的說明書進(jìn)行提取每個(gè)處理組DNA，DNA經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，EB顯色照相。
　　 結(jié)果:
　　 1.mHA系列化合物細(xì)胞毒性測(cè)定:測(cè)定mHA1-19對(duì)人白血病細(xì)胞HL-60/Bcl-2的細(xì)胞毒性并計(jì)算其IC50，結(jié)果顯示該系

19、列化合物中mHA1，6，11具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，選擇這3種化合物進(jìn)行后續(xù)的生物學(xué)評(píng)價(jià)和抗腫瘤機(jī)制研究。
　　 2.mHA系列化合物構(gòu)效分析:對(duì)該系列化合物進(jìn)行構(gòu)效分析，發(fā)現(xiàn)C6位點(diǎn)上連接二甲氨基與苯基對(duì)化合物活性的影響類似但優(yōu)于羥基，羥基優(yōu)于氨基;mHA7，15，17活性均很差，提示C7位點(diǎn)添加任何基團(tuán)均會(huì)降低化合物的活性。
　　 3.mHA1，6，11抗腫瘤活性明顯強(qiáng)于其母體藥物HA14-1:分別用不同濃度的HA14

20、-1和mHA1，6，11處理人白血病HL-60/Bcl-2細(xì)胞，24h或72h后測(cè)定細(xì)胞活力，結(jié)果顯示mHA1，6，11的IC50均小于1μM，而HA14-1的IC50為9.394±0.18μM，mHA1，6，11抗腫瘤活性明顯強(qiáng)于其母體藥物HA14-1。
　　 4.mHA1，6，11對(duì)人白血病細(xì)胞具有較強(qiáng)細(xì)胞毒性，但對(duì)正常小鼠骨髓細(xì)胞毒性較低:分別對(duì)人白血病HL-60/Bcl-2細(xì)胞及正常小鼠骨髓細(xì)胞進(jìn)行相同濃度的mHA1，6

21、，11藥物處理，72h后分別測(cè)定細(xì)胞活力。結(jié)果顯示1μM mHA1，6，11可以殺死約一半的腫瘤細(xì)胞，而1μM藥物處理對(duì)正常小鼠骨髓細(xì)胞幾乎無影響。
　　 5.mHA1，6，11對(duì)人正常骨髓細(xì)胞幾乎無毒性:采集人正常骨髓細(xì)胞進(jìn)行不同濃度的mHA1，6，11藥物處理，72h后分別測(cè)定細(xì)胞活力。結(jié)果顯示3μM mHAs可殺死幾乎全部的惡性HL-60/Bcl-2細(xì)胞，而同樣處理對(duì)人正常骨髓細(xì)胞幾乎毫無影響。
　　 6.陽性對(duì)照

22、藥物秋水仙堿對(duì)正常小鼠骨髓細(xì)胞毒性較大:采用秋水仙堿位點(diǎn)代表藥物秋水仙堿作為陽性對(duì)照，對(duì)人白血病HL-60/Bcl-2細(xì)胞及正常小鼠骨髓細(xì)胞進(jìn)行相同濃度藥物處理，72h后分別測(cè)定細(xì)胞活力，結(jié)果顯示秋水仙堿對(duì)腫瘤細(xì)胞及正常骨髓細(xì)胞均有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，盡管其IC50值在人白血病細(xì)胞中僅為33.5±3.5 nM，但藥物濃度在25nM時(shí)即可殺傷約30％的正常骨髓細(xì)胞。
　　 7.mHA1，6，11可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞喪失克隆形成能力:人白血病

23、HL-60/Bcl-2細(xì)胞在接受藥物處理后培養(yǎng)10～14d后計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)，計(jì)算所得IC50值低于細(xì)胞毒性試驗(yàn)，提示藥物處理不僅能在72h內(nèi)迅速殺死腫瘤細(xì)胞，并可引起部分細(xì)胞喪失增殖能力及克隆形成能力。
　　 8.mHA1，6，11引起腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特殊形態(tài)改變:mHA1，6，11可引起腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特殊形態(tài)改變。人白血病HL-60/Bcl-2細(xì)胞由懸浮細(xì)胞典型的球體變?yōu)椴灰?guī)則形、細(xì)胞變長及出現(xiàn)長偽足;人肺癌CRL5908細(xì)胞則由貼

24、壁細(xì)胞典型的梭狀變?yōu)槎噙呅位蝾悎A形。
　　 9.計(jì)算機(jī)模擬對(duì)接研究顯示mHA1，6，11可結(jié)合于微管蛋白上的秋水仙堿位點(diǎn):計(jì)算機(jī)模擬對(duì)接研究采用DAMA-秋水仙堿晶體結(jié)構(gòu)作為模板，模擬計(jì)算結(jié)果顯示mHA1，6，11與秋水仙堿均可結(jié)合于微管蛋白上的相同位點(diǎn)-秋水仙堿位點(diǎn)，mHA1，6和秋水仙堿結(jié)合模式相似而mHA11結(jié)合模式略有不同。
　　 10.秋水仙堿-微管蛋白競爭結(jié)合試驗(yàn)證實(shí)了mHA1，6，11可與秋水仙堿競爭結(jié)合位

25、點(diǎn):秋水仙堿-微管蛋白競爭結(jié)合試驗(yàn)顯示mHA1，6，11可與放射性標(biāo)記的秋水仙堿競爭結(jié)合位點(diǎn)，抑制其與微管蛋白結(jié)合，其作用呈劑量依賴性方式。
　　 11.微管蛋白聚合實(shí)驗(yàn)顯示mHA1，6，11和秋水仙堿均可抑制微管蛋白聚合，紫杉醇可促進(jìn)微管蛋白聚合:微管蛋白聚合實(shí)驗(yàn)顯示紫杉醇可促進(jìn)微管蛋白聚合，mHA1，6，11和秋水仙堿均可抑制微管蛋白聚合，證實(shí)mHA1，6，11具有強(qiáng)效的抗微管聚合作用。
　　 12.免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)

26、證實(shí)mHA1，6，11可降低細(xì)胞內(nèi)微管含量并破壞其網(wǎng)狀分布:人肺癌CRL5908細(xì)胞接受1μM mHA1，6，11處理24h后行免疫熒光檢測(cè)，顯示胞漿內(nèi)沿細(xì)胞長軸密集分布的微管變?yōu)閺浬⒎植?，且熒光?qiáng)度明顯降低，提示細(xì)胞內(nèi)微管含量減少。
　　 13.mHA1，6，11可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生G2/M細(xì)胞周期阻滯:人白血病HL-60/Bcl-2細(xì)胞在接受1μM mHA1，6，11藥物處理24h后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)細(xì)胞發(fā)生特異性G2/M細(xì)

27、胞周期阻滯。
　　 14.DNA碎片分析證實(shí)mHA1，6，11可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡:mHA1，6，11及秋水仙堿處理人白血病HL-60/Bcl-2細(xì)胞24h后行DNA碎片分析，出現(xiàn)明顯的凋亡條帶，證實(shí)秋水仙堿及mHA1，6，11均可誘導(dǎo)人白血病HL-60/Bcl-2細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究獲得了一系列HA14-1類似物并證實(shí)其為具有高效抗腫瘤活性的微管蛋白抑制劑。
　　 2.對(duì)該系

28、列化合物的構(gòu)效分析發(fā)現(xiàn)C6位點(diǎn)上連接二甲氨基與苯基類似但均優(yōu)于羥基，羥基優(yōu)于氨基;C7位點(diǎn)上不宜連接任何側(cè)鏈，為日后繼續(xù)研發(fā)新型微管蛋白抑制劑提供了設(shè)計(jì)思路。
　　 3.本研究結(jié)果證明了mHA1，6，11具有較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞殺傷作用，其IC50為納摩爾級(jí)別，大大優(yōu)于其母體藥物HA14-1，而且對(duì)正常細(xì)胞毒性較小，具有進(jìn)一步研發(fā)成藥的可能性。
　　 4.計(jì)算機(jī)模擬對(duì)接研究及秋水仙堿-微管蛋白競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)mHA1，6，11

29、均結(jié)合于微管蛋白上的秋水仙堿位點(diǎn)并可與秋水仙堿競爭結(jié)合位點(diǎn)，為作用于秋水仙堿位點(diǎn)的新型微管蛋白抑制劑。
　　 5.微管蛋白聚合實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)mHA1，6，11與紫杉醇作用方式相反，與秋水仙堿作用方式一致，為促微管蛋白解聚劑。
　　 6.免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)顯示mHA1，6，11可降低細(xì)胞內(nèi)微管數(shù)量及破壞胞漿內(nèi)正常微管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
　　 7.流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期檢測(cè)及DNA碎片分析實(shí)驗(yàn)證實(shí)mHA1，6，11通過阻滯腫瘤細(xì)胞