那可丁通過抑制HIF-1α提高低氧卵巢癌細(xì)胞化療敏感性.pdf

1、那可丁通過抑制HIF-1α提高低氧卵巢癌細(xì)胞化療敏感性低氧是眾多實(shí)體腫瘤生長到一定程度時(shí)所具備的共同特征，而核轉(zhuǎn)錄因子HIF-1（低氧誘導(dǎo)因子-1）是低氧條件下調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝以介導(dǎo)腫瘤生存的關(guān)鍵因子，它通過調(diào)控下游60 多種腫瘤生存相關(guān)靶基因的表達(dá)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，與實(shí)體腫瘤的血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移、放化療耐受等惡性生物學(xué)行為密切關(guān)聯(lián)。HIF-1α是HIF-1的關(guān)鍵調(diào)控亞基，在70％實(shí)體瘤高表達(dá)并與腫瘤放、化療敏感性密切相關(guān)。卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)

2、最常見的惡性腫瘤之一，盡管腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合以紫杉醇+鉑類藥物為主的術(shù)前輔助化療及術(shù)后化、放療等綜合治療模式已大大延長了卵巢癌患者的生存時(shí)間，但其五年生存率仍停滯在30％左右，究其原因，除了患者就診時(shí)多為中晚期以外，化療耐藥尤其是多藥耐藥是導(dǎo)致患者復(fù)發(fā)及最終廣泛轉(zhuǎn)移的主要原因。HIF-1α在卵巢癌有較高表達(dá)，我們由此猜測HIF-1α是導(dǎo)致卵巢癌化療敏感性下降的重要因素。本研究以人卵巢癌細(xì)胞株C13K 為研究對象，檢測常氧及低氧條件下小分

3、子化合物那可丁對其化療敏感性的影響，并在mRNA水平和蛋白水平探討那可丁對HIF-1α的調(diào)控機(jī)制，通過檢測HIF-1α定位、轉(zhuǎn)染HIF-1α熒光報(bào)告質(zhì)粒、檢測HIF-1下游靶基因的mRNA表達(dá)來研究那可丁對HIF-1 轉(zhuǎn)錄活性的影響，為將那可丁用于以HIF-1α為靶點(diǎn)的卵巢癌輔助化療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分低氧對卵巢癌細(xì)胞化療敏感性的影響
　　 目的：探討低氧對卵巢癌細(xì)胞株C13K 化療敏感性的影響。
　　

4、 方法：低氧誘導(dǎo)劑CoCl2 處理C13K細(xì)胞，臺盼藍(lán)排除實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞存活率、western blotting 檢測HIF-1α蛋白表達(dá)水平以確認(rèn)是否成功建立“有效低氧”。之后，C13K細(xì)胞分為常氧組和低氧組，梯度濃度順鉑作用后，MTT 法檢測細(xì)胞增殖情況。
　　 結(jié)果：CoCl2提高C13K細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)水平且對細(xì)胞存活率無明顯影響；順鉑顯著抑制C13K細(xì)胞增殖能力（P<0.05）且該效應(yīng)具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性

5、，該效應(yīng)在常氧組較在低氧組顯著（P<0.05）。
　　 結(jié)論：人卵巢癌細(xì)胞C13K的“有效低氧”成功建立；低氧能降低人卵巢癌細(xì)胞C13K 對順鉑的化療敏感性。
　　 第二部分那可丁對卵巢癌細(xì)胞化療敏感性的影響
　　 目的：檢測那可丁對卵巢癌細(xì)胞化療敏感性的影響。
　　 方法：常氧和低氧培養(yǎng)的C13K細(xì)胞各分為四組：對照組，那可丁組，順鉑組，那可丁/順鉑組，臺盼藍(lán)排除實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋

6、亡率。
　　 結(jié)果：低氧條件下那可丁/順鉑組細(xì)胞死亡率及凋亡率均顯著高于順鉑組（P<0.05），常氧條件下那可丁/順鉑組與順鉑組細(xì)胞死亡率及凋亡率無明顯差別。
　　 結(jié)論：那可丁提高低氧卵巢癌細(xì)胞C13K 對順鉑的化療敏感性。
　　 第三部分那可丁對HIF-1α的抑制作用
　　 目的：檢測常氧和低氧條件下那可丁對人卵巢癌細(xì)胞C13K中HIF-1α表達(dá)和HIF-1 轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　 方法：C1

7、3K細(xì)胞分常氧組對照組、常氧那可丁組、低氧組對照組、低氧那可丁組，采用RT-PCR、western blotting、免疫熒光分別檢測各組細(xì)胞HIF-1α、MDR1、Bax的mRNA表達(dá)、HIF-1α蛋白表達(dá)和HIF-1α細(xì)胞內(nèi)表達(dá)定位情況；低氧對照組、低氧那可丁組C13K細(xì)胞均用放線菌酮作用梯度時(shí)間后，western blotting 檢測細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)水平；低氧培養(yǎng)C13K細(xì)胞，分四組（對照組，那可丁組，MG132組，那可

8、丁+MG132組）處理后，western blotting檢測各組細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)水平；HIF-1的熒光報(bào)告質(zhì)粒pGL3-VEGF-HRE和陰性對照質(zhì)粒pGL-Promoter vector 轉(zhuǎn)染C13K細(xì)胞，分常氧對照組、常氧那可丁組、低氧對照組、低氧那可丁組處理所需時(shí)間后，檢測各組細(xì)胞熒光素酶活性。
　　 結(jié)果：那可丁對HIF-1αmRNA 水平無明顯影響，但那可丁能通過縮短HIF-1α半衰期明顯降低其蛋白水平，該抑