肝癌HepG2細胞IER5基因低表達細胞系的建立及其輻射效應(yīng)研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(primary carcinoma of the liver,PLC,簡稱肝癌)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一。在我國,肝癌在腫瘤相關(guān)死亡中僅次于肺癌,位居第二位。近年來由于三維適型放療技術(shù)的發(fā)展,放療已成為肝癌治療的有力武器。輻射敏感性是影響腫瘤放療效果的重要因素之一,輻射敏感性受輻射敏感基因調(diào)節(jié)。為增加腫瘤的輻射敏感性、提高腫瘤放療療效,人們試圖從基因?qū)用鎸ふ覍椛涿舾械幕?。如果該基因在輻射之后出現(xiàn)表達變化,且這種表達變

2、化能夠促進腫瘤細胞凋亡或抑制腫瘤細胞生長,那么該基因?qū)δ[瘤放療就很有意義。IER5(Immediate Early Response5)基因是早期慢反應(yīng)基因家族的一員,研究發(fā)現(xiàn)IER5基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、調(diào)節(jié)細胞周期、促進細胞有絲分裂過程中發(fā)揮重要作用。我們的前期研究顯示IER5基因在輻射后的裸鼠肝癌組織中呈現(xiàn)高表達,提示IER5基因可能與肝癌的輻射敏感性有關(guān),在維持肝臟正常生理功能及肝癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮一定作用。
　　

3、 核糖核酸干擾(RNA Interference,RNAi)是指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA(double stranded RNA,dsRNA)介導(dǎo)細胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解,從而導(dǎo)致靶基因表達沉默,產(chǎn)生相應(yīng)功能表型缺失的現(xiàn)象。腫瘤的發(fā)生與基因變異或病毒入侵密切相關(guān),應(yīng)用RNAi技術(shù)可關(guān)閉某些特異性基因,從而達到治療這些疾病的目的。RNAi技術(shù),尤其是應(yīng)用化學(xué)合成的小分子RNA干擾(Small interfering RNA,siRNA

4、)技術(shù)是功能基因分析的重要方法,因其可能成為腫瘤治療的重要手段而倍受關(guān)注。
　　 細胞周期是指細胞從第一次分裂結(jié)束產(chǎn)生新細胞到第二次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程,分為間期和分裂期。間期又分為DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)與DNA合成后期(G2期)。細胞分裂期指M期,包括前期、中期、后期和末期,末期又稱為GO期,GO期是細胞停止分裂,去執(zhí)行一定生物學(xué)功能的的時期。細胞周期從G1→S→G2→M期的順序運轉(zhuǎn)中有兩個關(guān)鍵的“檢

5、定點”,一個G1/S,一個是G2/M。只有前一階段的生理活動完成后,才能通過檢定點階段,進入周期的下一步,一些突發(fā)事件引發(fā)的細胞反應(yīng)能影響驅(qū)動細胞周期前進的因子,使細胞周期停滯在檢定點,稱為細胞周期阻滯(cell cycle arrest)。
　　 目前國內(nèi)外對IER5基因的研究不多,該基因的生物學(xué)功能尚不明確,尚乏有關(guān)IER5基因與肝癌關(guān)系的研究報道,本實驗以離體培養(yǎng)的肝癌HepG2細胞為研究對象,采用siRNA技術(shù)構(gòu)建IER

6、5表達抑制細胞模型(HepG2-IER5-siRNA),選擇生長曲線、細胞周期為實驗參數(shù),研究IER5基因表達抑制對HepG2細胞增殖、細胞周期及輻射效應(yīng)的影響,探討該基因的生物學(xué)功能,探求該基因能否成為肝癌的輻射敏感基因,期望為臨床肝癌放療尋找到新的增敏靶點,以提高放療效果,改善肝癌患者的預(yù)后。
　　 目的:
　　 本課題選擇離體培養(yǎng)HepG2細胞為研究對象,采用siRNA技術(shù),轉(zhuǎn)染HepG2細胞,建立IER5基因表達

7、抑制細胞模型,探討IER5基因表達抑制對HepG2細胞增殖、細胞周期及輻射效應(yīng)的影響,進一步探討該基因的生物學(xué)功能,探求該基因能否成為肝癌的輻射敏感基因。
　　 方法:
　　 1 IER5基因表達抑制細胞模型HepG2-IER5-siRNA的建立:設(shè)計特異性干擾RNA片段,構(gòu)建IER5的siRNA抑制表達載體(A-1、A-2、A-3)。利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù),轉(zhuǎn)染HepG2細胞,建立IER5基因表達抑制細胞模型。同

8、時設(shè)立陰性對照(HepG2-NC),即將與人類編碼基因序列無同源性的片段與載體連接轉(zhuǎn)染細胞。采用Real-time PCR及WesternBlot技術(shù)分別檢測HepG2細胞IER5基因mRNA和蛋白的表達,篩選有效抑制IER5基因表達的單克隆細胞系。
　　 2研究抑制IER-5基因表達對HepG2細胞增殖、細胞周期和輻射效應(yīng)的影響:檢測0Gy、2Gy、4Gy輻射情況下的細胞生長曲線,采用流式細胞術(shù)檢測0Gy、4Gy輻射下細胞周期

9、的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1 IER5基因表達抑制HepG2細胞模型(HepG2-IER5-siRNA)的建立:Real-time PCR結(jié)果顯示相對于HepG2-NC細胞,轉(zhuǎn)染編號為A-3載體的細胞IER5基因RNA下調(diào)百分比為79.3％,同時Western Blot技術(shù)檢測到該細胞系IER5蛋白表達水平下降明顯;證明轉(zhuǎn)染后細胞IER5基因表達受到抑制。認為轉(zhuǎn)染A-3載體的細胞為有效抑制IER5基因表達的細胞模型,

10、定義為HepG2-IER5-siRNA細胞系。
　　 2 IER5基因表達抑制對離體HepG2細胞增殖的影響:分別計數(shù)HepG2-NC細胞和HepG2-IER5-siRNA細胞0Gy、2Gy、4Gy Co60γ射線照射后1-6天的細胞數(shù),繪制細胞生長曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn):HepG2-IER5-siRNA細胞在0Gy、2Gy、4Gy輻射后第3或4天生長速度較HepG2-NC細胞開始增快,第6天時細胞數(shù)明顯高于HepG2-NC。
　

11、　 細胞接種后24小時,采用流式細胞術(shù)檢測未輻射的HepG2-NC細胞和HepG2-IER5-siRNA細胞在細胞周期不同階段(G0/G1期、G2/M期、S期)的細胞百分率,HepG2-IER5-siRNA與HepG2-NC細胞處于S期的細胞百分率分別為(39.80±2.02)％和(32.30±0.02)％,P＜0.05。上述兩種細胞G0/G1期百分率分別為(48.55±2.06)％和(48.04±1.54)％,P＞0.05。說明抑制

12、IER5基因表達,HepG2細胞的增殖能力增強,與生長曲線結(jié)果一致。
　　 3 IER5基因表達抑制對離體HepG2細胞輻射敏感性的影響:進行4Gy Co60γ射線照射后各時間點細胞周期檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn):HepG2-IER5-siRNA輻射后12小時G2/M期細胞百分率明顯高于0小時((52.44±4.74)％vs(21.98±0.96)％,P＜0.05);HepG2-NC細胞輻射后12小時G2/M期細胞百分率亦明顯高于0小時((

13、49.00±4.58)％vs(23.36±2.20)％,P＜0.05)。說明照射后12小時,HepG2-IER5-siRNA細胞與HepG2-NC細胞均出現(xiàn)G2/M期阻滯。
　　 輻射后24小時HepG2-IER5-siRNA G2/M期細胞百分率與0小時無顯著差異((20.73±1.04)％vs(21.98±0.96)％),P＞0.05),說明此時細胞周期阻滯已解除。而HepG2-NC輻射后24小時G2/M期細胞百分率仍明顯高

14、于0小時((31.85±4.586)％vs(23.36±2.20)％,P＜0.05),說明此時HepG2-NC細胞仍有部分維持阻滯于G2/M期。輻射后24小時,HepG2-IER5-siRNA的S期細胞比例明顯高于HepG2-NC((14.71±1.04)％vs(6.14±0.44)％,P＜0.05)。說明抑制IER5基因表達,HepG2細胞對輻射損傷的修復(fù)能力增強,即抗輻射能力增強,提示輻射敏感性減弱。
　　 結(jié)論:
　

15、　 1本研究成功建立了一種IER5基因表達抑制的單克隆細胞系:HepG2-IER5-siRNA細胞系。
　　 2抑制IER5基因的表達可促進HepG2細胞增殖,使其進入S期的細胞比例增加。
　　 3抑制IER5基因表達,HepG2細胞對輻射損傷的修復(fù)能力相對增強,輻射敏感性減弱。
　　 本研究對IER5基因的生物學(xué)功能進行了有益的探索,在此基礎(chǔ)上,對應(yīng)用干擾RNA技術(shù)治療腫瘤進行了初步探討。主要創(chuàng)新點在于發(fā)現(xiàn)抑